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1、非病毒基因活化机制转染ephrinB2用于内源性牙周组织再生的实验研究1.研究目标(1)探索ephrinB2-P日GAMs的最优制备方式，考察其转染效果，验证PDLSCs经ephrinB2-P日复合物转染后的成骨、成血管能力，明确将ephrinB2-PElGAMS作为ephrinB2体内移植载体的可行性。(2)明确ephriB2-PEIGAMs用于修复牙周组织缺损的疗效，包括牙周组织再生情况.血管形成情况等，揭示可能的修复机制，为临床应用提供依据。2.研究方法(1)研究转染ephrinB2的犬PDLSCs促进缺损区成骨、成血管、组织再生的情况及机制比格犬牙周组织缺损模型的建立拔除比格犬双侧下颌
2、第三前磨牙后,于第二前磨牙远中、第四前磨牙近中分别磨除一定体积的牙槽骨，制备牙周组织缺损。犬PDLSCs的培养、转染、包埋、移植培养犬PDLSCs后，用慢病毒转染ephrinB2,然后将细胞包埋在PUramatriX胶中，植入缺损区。3评价缺损区成骨、成血管、组织再生情况植入细胞3个月后，截取缺损区组织，micro-CT摄片计算新生骨量HE染色分析新生骨、新生血管情况及牙周组织再生情况；免疫组化、免疫荧光RUnX2/OPG/RANKL/CD31/SM)检测成骨、成血管情况及上下游分子表达情况。(2)EPhrinB2-P日GAMs的构建和转染效率检测摸索ephrinB2-P日GAMs的最优制备方
3、法采用梯度N/P比和梯度DNA剂量混合制备DNA-P日复合物。将复合物与PDLSCs细胞混合孵育，使用流式细胞术鉴定基因转染效率。制作纳米羟基磷灰石胶原，并将其与DNA-PEl复合物组装。评价eph而B2-P日复合物转染PDLSCs后，细胞增殖、迁移及基因、蛋白水平的变化使用优化的ephrinB2-P日复合物(FIag作为对照组)转染PDLSCs,3天后收集细胞，CCK-8检测细胞增殖，细胞迁移实验检测细胞迁移,Real-timePCR、Westernblot检测ephrinB2EPhB4、Notch、DLL4、ALP基因和蛋白的表达情况。3；检测ephrinB2-PEI复合物转染PDLSCs
4、后，自身成骨能力、促前成骨细胞成骨及促血管形成能力的变化使用不同的ephrinB2-P日复合物(Flag作为对照组)转染PDLSCs,3天后收集细胞，检测自身成骨能力、促前成骨细胞成骨能力及促血管形成能力，检测方法同前。(3)EphrinB2-PEGAMs促进组织再生能力及机制的研究制作比格犬牙周组织缺损模型，将不同的ephrinB2-P日GAMs植入缺损区，Flag作为对照，并放置bio-guide膜避免牙龈纤维长入。3个月后，截取缺损区组织，micro-CT、HE染色、免疫组化分析成骨、成血管、组织再生情况，并使用免疫组化、免疫荧光分析局部细胞成骨相关上下游分子表达的情况。3.社会效益及研
5、究成果我们初步研究了不同浓度的PDLSCs包埋在0.2596的puramatrix中，以及IXIo6/ml的PDLSCs包埋在不同浓度puramatrix中的增殖情况，并电镜下对包埋在PUramatriX中的细胞形态进行了观察。将转染ephrinB2的犬PDLSCS植入牙槽骨缺损区，发现新骨形成量明显高于对照组。非病毒基因活化基质(GAMs)可作为载体，实现ephrinB2质粒体内递送,达到转染内源性干细胞，促进组织再生的目的。使用非病毒基因活化基质作为载体，将ephrinB2信号分子导入牙周缺损区，转染内源性干细胞，可增强局部组织修复能力，促进牙周组织再生。研究成果已经分别发表在Intern
6、ationalJournalofMolecularMedicine(影响因子:2.928)和(JournalofTissueEngineering(影响因子：4.148)本项目的特色与创新之处；(1)使用非病毒基因活化基质进行内源性牙周组织再生，具有安全、简单、易于接受的优势，临床应用前景良好。传统的牙周组织工程，需要体外培养种子细胞，存在细胞来源困难，培养周期长、费用高，干细胞特性丧失等问题，限制了研究成果的进一步转化及临床应用。使用非病毒基因活化基质进行内源性牙周组织再生，避免了体外细胞培养的诸多问题，具有安全、简单、易于接受的优势，与临床应用衔接更紧密，可以更好的实现研究成果转化与临床应
7、用。(2)首次将ephrinB2信号分子用于牙周组织工程中。EphrinB2信号分子被证实在成骨和成血管过程中均发挥着重要的作用，不仅能促进骨组织再生修复.同时也可以改善微循环障碍，有着双重功效，但ephrinB2对于牙源性干细胞特性的影响作用及机制尚无报道。本科题首次研究ephrinB2信号分子对于牙源性干细胞成骨、成血管、组织再生的影响.并创新性的将其用于牙周组织工程中，为牙周组织再生提供了新思路。(3)EphrinB2信号分子可增强细胞迁移能力、促进牙源性干细胞成骨，并能促进周围EphrinB2血管新生，是理想的生物信号分子信号分子可促进牙源性干细胞成骨并增强细胞迁移能力牙周组织缺损主要
8、是骨组织不同程度的丧失，骨再生是牙周组织再生的首ephrinB2要目的。因此，信号EphB4分子应参与协同、激活或促进干细胞成骨。近期研究发现，及其受体在骨改建中发挥重要作用。当上调人牙周膜干细胞信号分子后，细胞迁移能力增强，在成骨诱ephrinB2导条件下，成骨标志基因显著提高，形成的钙化结节显著增加。此外，高表达的人牙周膜干细ephrinB2胞与成骨前体细胞共培养时，能够促进成骨前体细胞成骨。该结果提示我们，EphrinB2对牙源性干细胞的成骨能力也具有显著作用。(4)EphrinB2/EphB4通过调节成骨细胞和破骨细胞的分化来维持体内骨组织的动态平衡，当干细胞的ephirnB2表达量提
9、高时，可以更多与相邻干细胞的EphB4受体结合，促进成骨细胞的形成，同时抑制破骨细胞的分化，从而提高成骨的效果。我们的前期研究也发现，当上调人牙周膜干细胞ephrinB2信号分子后，自身成骨能力提高，并能促进周围前成骨细胞成骨及血管内皮细胞形成血管网，可作为促进牙周组织再生的信号分子。有报道称，P日可以实现间充质干细胞的高水平转染，避免了慢病毒转染存在的生物危险性。PEI-质粒可以同胶原、胶原-粘多糖、胶原-纳米羟基磷灰石等支架材料结合，构建基因活化基质，植入体内后可以转染内源性干细胞高表达目的分子，实现内源性牙周组织再生。已有学者使用非病毒基因活化基质成功转染ephrinB2到间充质干细胞中
10、。基于ephrinB2的成骨、成血管能力，以及多领域非病毒基因活化基质的成功应用，所以我们提出使用ephrinB2-PEIGAMs进行内源性牙周组织再生的实验2、该项目应用现代细胞培养技术RT-PCR技术，免疫荧光技术影像诊断和图像micro-CT、HE染色、免疫组化染色技术，研究ephrinB2信号分子和牙周组织再生的关系3、体内和体外研究表明：ephrinB2分子促进比格犬牙周膜干细胞的成骨分化，进一步促进了牙槽骨修复，具有安全、简单、易于接受的优势4、项目成骨再核心期刊发表sci论文3篇，申请受理国家发明专利1项。5、通过项目实施，团队学术水平提升，培养硕士研究生3人、培养国家一级学会委
11、员2人、江苏省医学会专业委员会副主任委员1人、江苏省333”工程人才1人。1、该项目应用现代细胞培养技术RT-PCR技术，免疫荧光技术影像诊断和图像micro-CT、HE染色、免疫组化染色技术，研究ephrinB2信号分子和牙周组织再生的关系2、体内和体外研究表明：ephrinB2分子促进比格犬牙周膜干细胞的成骨分化，进一步促进了牙槽骨修复，具有安全、简单、易于接受的优势3、项目成骨再核心期刊发表sci论文3篇，申请受理国家发明专利1项。4、通过项目实施，团队学术水平提升，培养硕士研究生3人、培养国家一级学会委员2人、江苏省医学会专业委员会副主任委员1人、江苏省333工程人才1人。李长顺男1989.06朱绍跃男1984.03张昕女1990.01袁长永男1983.11王雯女1990.03主治医师硕士研究生主治医师博士主治医师硕士研究生副主任医师博士主治医师硕士
