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1、真菌感染实验诊断,第一节 真菌的基本特性 真菌是一大类具有典型细胞核,不含叶绿素,不分根、茎叶的真核细胞型微生物。,一、真菌的形态特性,(一)单细胞真菌呈圆形,如酵母菌。(二)多细胞真菌由菌丝和孢子组成,称丝状菌或霉菌。,菌丝和孢子的形态因菌而异,是鉴定真菌的重要依据。孢子又分为多种,如叶状孢子、分生孢子和孢子囊孢子等。,二、真菌菌落特性,真菌培养要求不高,常用沙氏(Sabouraud)培养基(含1蛋白胨、4葡萄糖或麦芽糖、2琼脂)培养,适宜温度2228,但深部真菌为37。形成三种菌落,菌落形态是鉴别真菌的重要依据。,1酵母型菌落 是单细胞真菌的菌 落,形态与细菌菌落相似,较大,表面光滑湿润柔
2、软、边缘整齐,如新生隐球菌。,2.类酵母型菌落 如白假丝酵母菌,形成假菌丝,伸人培养基中。,3霉菌型菌落 是多细胞真菌的菌 落。菌落呈棉絮状、绒毛状,并 产生不同的色素,如皮肤癣菌。,第二节 标本采集及检验程序,一、临床标本的采集(一)临床标本类别 1皮肤的角质性物质:毛发、指(趾)甲、皮屑等。,2各种分泌物和排泄物:生殖道 分泌物、耳垢、痰、粪便、尿 液等。,3血液和体液:体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。4脓汁及渗出物。,(二)采集标本注意事项,1.采集的标本要适宜 不同真菌感染 应采取不同的临床标本。怀疑为浅 部真菌感染如体癣,应刮取病变边 缘的痂、皮屑,发癣应取病发。深 部真菌
3、感染应取血液、脑脊液、脓 汁等。,2在用药前采集标本 一般真菌 标本须在用药前采集,对已用 药者则需停药一段时间后再采 集标本。,3采集的标本量要足 血液和脑 脊液标本5ml,胸腔液20ml,皮屑标本两块,活体组织两份(一份送病理科检查,一份作 镜检和培养)。,4严格无菌操作 并进行消毒处理,尤其是采集血液和脑脊液标本,要避免污染杂菌。5采集标本立即送检 深部真菌标 本最长不得超过2h。,第三节 真菌检验,一、标本直接检查(一)显微镜检查 直接镜检对真菌病的诊断较细菌更为重要。许多真菌标本不需染色即可直接镜检,如癣病 标本多用KOH湿片检查法,即取病发或病损部位 皮屑、甲屑置于载玻片上,加1滴
4、10-20 KOH 液,然后加盖玻片并微微加热,使标本组织溶解 透明,在显微镜下可观察到真菌的孢子和菌丝。,直接镜检的意义,直接镜检阳性表示:有诊断意义,如浅部真菌病等;看到的就是真菌的形态,可确定某 些致病性真菌的属或种,如假丝酵 母菌的厚膜孢子等;,判断某些真菌种的致病性等,如 皮肤癣菌、曲霉等。,直接镜检也有局限性:阴性结果不能排除真菌感染;有假阳性结果。因此,对直接镜检可疑结果应 作复查或用其他检验方法鉴定。,(二)抗原检测,常用的方法有胶乳凝集试验、ELISA、半定量放射免疫法。均应设对照,防止发生假阳性和假阴性。,用胶乳凝集试验检测标本中的白假丝酵母菌甘露聚糖抗原。用胶乳凝集试验和
5、ELISA检测血清和脑脊液中的隐球菌多糖荚膜抗原,在治疗前检测非常敏感特异。,用半定量放射免疫法检测血清、尿液和脑脊液中荚膜组织胞浆菌循 环多糖抗原,可快速诊断。,二、真菌的分离培养,真菌培养是目前鉴定真菌的惟一方法。培养真菌的温度为28,但深部真菌为37。菌落是鉴别真菌的方法。注意以下几点:,菌落性质:酵母菌还是霉菌;菌落大小,病原性真菌菌落小,而条件致病性真菌菌落大;,菌落颜色 病原性真菌颜色淡,污染真菌颜色深;致病性真菌菌落下沉,有时使 培养基开裂;污染性真菌菌落 不下沉,很少引起开裂。,三、真菌的生化反应,用于主要深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。1.糖(醇)类发酵试验 37孵育,观
6、察糖发酵情况。,2.同化碳源试验 含菌生理盐水 与已融化的固体同化碳源培养 基(45)混合,然后在培养基 上分别加糖,置25孵育观察 结果。若24h后无变化可重复 加糖。如能同化周围有生长圈,否则无生长。,3.同化氮源试验 同化碳源试 验相同,但需用无氮源的培 养基,不要加糖类,而加入 硝酸钾。,四、动物实验,实验的目的是分离病原性真菌、确定真菌菌种的致病性、研究药物 对真菌的作用等。如假丝酵母菌接 种家兔或小白鼠,肾脏明显肿胀,肾皮质部位有白色脓疡。,五、核酸检测,医学真菌的鉴定手段引入了分子生物学的鉴定方法,从核酸碱基G+C mol分析、限制性片段长度多态性(RFLP)、Southern印
7、迹分析到脉冲场凝胶电泳(PFGE)、PCR指纹、随机扩增多态性DNA(RAPD)以及DNA特殊片段测序等。,(一)G+Cmol分类鉴定法,常用热变性温度法。原理是DNA加热变性使碱基氢键被打开,双链螺旋变成单链,导致核苷酸碱基在260nm紫外吸收明显增加,完全变成单链后,紫外吸收增加停止。紫外吸收增加的中点值温度为热变性温度(Tm)。若真菌DNA中G+C碱基对含量多,Tm值就高。可直接反映G+C碱基对的绝对含量。计算公式为:G+Cmol=(Tm-53.9)2.44,(二)真菌核型的脉冲电泳分析,脉冲凝胶电泳技术(PFGE)解决了真菌大分子DNA的分离技术难题。,原理:PFGE有两个方向的电场在
8、设定的脉冲时间里交替变换,使大分子DNA在移动中不断改变自己的形状及迁移方向,从而绕过细小的凝胶孔隙而得以分离。较大的DNA分子泳动慢些,较小的快些,有许多因素影响电泳带型,分离真菌等大分子量的DNA宜用较低电压和较长脉冲时间。,用PFGE分析真菌核型,可直接比较其遗传背景,从电泳核型差异中进行分类鉴定,又能取得基因结构的基本数据,构建出大尺度物理图谱。,(三)随机扩增多态性 DNA(RAPD)分析,RAPD分析是一种利用随机合成的单个寡核苷酸引物,通过PCR扩增靶细胞DNA,扩增产物凝胶电泳,分析DNA片段大小和数量的多态性,从而比较靶基因差异的一种技术。由于病原性真菌基因组庞大,RAPD分析适用于真菌的鉴定与分类。,六、真菌毒素的检测,真菌产生有毒的代谢产物,可引起急慢性真菌中毒症,引起消化道中毒症状,而且可进入人体内引起病变,如引起肝脏损伤的黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素;引起肾脏损害的桔青霉素;引起中枢神经系统损害的黄绿青霉素等。甚至有的毒素具有致癌性,如黄曲霉毒素与肝癌发生有关。,检测真菌毒素有许多方法,如检测黄曲霉毒素有生物学方法和ELISA法等。生物学方法主要用于检测真菌毒素的毒性,如用鸡胚、小白鼠作毒性试验,观察动物中毒死亡或出现肿瘤。ELISA法操作简便,并具有安全快速高效、费用低,适用于大批量标本的筛选。,
