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1、ICS65.020.30CCSB44中国实验动物学会团体标准T/CALASx-201x实验动物小鼠和大鼠成瘾行为实验规范1.aboratoryanimal-StandardOperatingProcedureforAddictiveBehaviorsinRatsandMice（征求意见稿）201 x-xx-xx 发布201x-xx-xx实施中国实验动物学会发布1刖S本文件按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本标准附录为规范性附录(或资料性附录)。本标准由中国实验动物学会归口。本标准由全国实验动物标准化技术委员会(
2、SAC/TC281)技术审查。本标准由中国实验动物学会实验动物模型鉴定及评价工作委员会组织。本标准起草单位：中南大学湘雅二医院、宁波市康宁医院、军事医学科学院、北京大学中国药物依赖性研究所、新乡医学院、北京大学药学院、上海精神卫生中心、中科院深圳先进院、广州医科大学附属脑科医院、北京大学基础医学院、华中科技大学。本标准主要起草人：张晓洁、刘惠芬、宋睿、薛言学、赵斌、梁建辉、袁逖飞、朱英杰、范妮、李亦婿、王刚。实验动物小鼠和大鼠成瘾行为实验规范1范围本文件规定了小鼠和大鼠成瘾行为实验设备材料、实验方法和评价指标。本文件适用于从事小鼠和大鼠的成瘾发生发展机制、药物研发等专业机构、教学和科研人员。2
3、规范性引用文件下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14925-2010实验动物环境及设施GB/Z34792-2017实验动物引种技术规程GB/T34791-2017实验动物质量控制要求GB/T35823-2018实验动物动物实验通用要求GB/T35892-2018实验动物福利伦理审查指南GBT39760-2021实验动物安乐死指南GBT39759-2021实验动物术语GBT39650-2020实验动物小鼠、大鼠品系命名规则GBT39646-2020实验动物健康监测总则T
4、/CALAS75-2019实验动物小鼠和大鼠情绪行为实验规范T/CALAS74-2019实验动物小鼠和大鼠学习记忆行为实验规范3术语和定义以下术语和定义适用于本标准。3.1物质成瘾substanceaddiction物质成瘾是由于反复使用某种物质所引起的一种周期性或慢性中毒状态，其特征表现为不可控制的渴求和觅药行为、突然停药或减量后出现戒断症状、对药物耐受性增加等行为。3.2成瘾物质addictivesubstance成瘾物质是指能够影响机体情绪、行为或意识状态，使机体产生成瘾行为的所有外源性化学物质。3.3戒断症状withdrawalsymptoms戒断症状是在反复使用成瘾物质之后，突然减药
5、、撤药或者阻断药物作用，机体出现一系列生理反应。3.4条件性位置偏爱conditionedplacepreference条件性位置偏爱是实验动物通过将药物的正性强化效应与某个中性环境反复训练建立了关联后，对该环境信息产生偏爱行为的实验。3.5自身给药self-administration自身给药是实验动物通过自主压杆及鼻触等操作获得药物注射的操作式行为实验。3.6行为敏化behavioralsensitization行为敏化是实验动物在反复间断给予成瘾性物质后，对药物反应增加的行为实验。3.7药物辨别drugdiscrimination药物辨别是实验动物通过训练能否区分两种或两种以上的药物的行
6、为实验。4成瘾行为实验方法4.1 戒断实验4.1.1 实验材料4.1.1.1 实验动物a）清洁级或更高等级的成年雄性健康C57小鼠、昆明小鼠、ICR小鼠、SD大鼠、Wistar大鼠等作为建模动物。以下以昆明小鼠和SD大鼠为例进行说明。b）自由饮食，适应环境57天后开始实验。4.1.1.2 实验设备a）戒断实验基本装置包括测试箱、摄像头、视频分析软件。b）测试箱透明，无垫料，便于清楚观察戒断症状、准确采集排尿腹泻等信息。4.1.1.3 实验药品阿片类物质如吗啡、海洛因、可待因等。4.1.2 实验方法4.1.2.1 自然戒断实验a）建模期：给药方式：皮下注射、肌肉注射、腹腔、静脉注射等。以下以盐酸
7、吗啡注射液（IOmg/ml）腹腔注射为例进行说明。给药频次：每天23次。给药剂量：大鼠日剂量从15,30,45到150mgkg递增，或者增加到90mgkg-150mgkg后恒量，持续30天。b）测试期：末次给药1520h后，开始观察自然戒断症状，每天同一时间点观察30min及测量体重变化，连续记录710天。4.1.2.2 催促戒断实验a）建模期：给药方式：皮下注射、肌肉注射、腹腔、静脉注射，灌胃或皮下埋植等。给药频次：每天23次。给药剂量：大鼠日剂量从15,30,45到150mgkg递增，或者增加到90mgkg-150mgkg后恒量，持续15天S小鼠日剂量从30到300mgkg,或者增加到21
8、Omgkg-300mgkg后恒量,持续510天。b）测试期：末次给药6h内，腹腔注射纳洛酮2mgkg-5mgkg催促戒断，立即观察给药后30min内戒断症状和体征。4.1.3 评价指标4.1.3.1 自然戒断实验评价指标小鼠自然戒断后缺乏特征性戒断体征和症状，以体重下降指数作为核心评价指标。大鼠自然戒断症状的表现明显，容易观察。大鼠自然戒断症状评分表如下：将以下九项得分进行相加，算出戒断症状评分总分。a）跳跃、湿狗样抖动、扭体、摇头、打哈欠、扫尾。O分=无；1分=15次；2分=610次：3分10次。b）齿颤、咀嚼（次与次间隔3秒）。O分=无；1分=l10次；2分=ll20次；3分20次。c）流
9、涎：嘴四周湿润为“+”=1分；湿而充盈为“+”=2分；分泌液流出为“+”=3分。d）流泪：眼圈湿润为“+”=1分；湿而充盈为“+”=2分；眼圈周围毛湿为“+”=3分。e）竖毛：以颈部毛发直立为准，有记为1分，无记为O分。f）激惹：触碰动物萎缩不动为O分；有攻击行为但不尖叫为“+”=1分；有尖叫但无攻击行为为“+”=2分；触碰尖叫并伴有攻击行为为“+”=3分。g）眼睑下垂：眼睑闭合Vlomin为“+”=1分;约1020min为“+”=2分;20min以上为“+”=3分。h）腹泻：稀便有形为“+”=1分；稀便不成形为“+”=2分；稀滩便为“+”=3分。i）鼻分泌物：四周湿润为“+=I分：湿而充盈为
10、“+”=2分；分泌液流出为“+”=3分。4.1.3.2 催促戒断实验评价指标a）跳跃和体重下降是小鼠催促戒断症状和体征的核心评价指标，此外，还可以观察到竖尾、扭体、震颤、短暂痉挛、流涎、上睑下垂、腹泻、呼吸频率和深度增加，自发活动明显增多等。b）大鼠催促戒断评价指标和自然戒断相同。4.2 自身给药行为实验4.2.1 实验材料4.2.1.1 实验动物a）采用清洁级或更高清洁等级的成年雄性健康C57/BL小鼠和SD大鼠。b）静脉插管手术时大鼠体重280g320g,小鼠体重20g22g.c）训练期间动物自由饮水，每天限食，实验操作在8：00-18：00之间完成。4.2.1.2 实验装置a）自身给药装
11、置为操作性行为训练箱（20CmXI5cmxl8cm）,放置具备通风功能的隔音箱中。b）自身给药训练箱左侧或右侧墙壁的左上方有照明笼灯，在对面墙壁距离底板4.5Cm的位置有左右2个伸缩压杆或鼻触孔（直径2cm）,在压杆或鼻触孔上面L5cm有信号灯。c）训练箱尺寸和参数可根据实验动物和实验要求进行具体调整。4.2.2 实验方法以下以甲基苯丙胺静脉给药途径为自身给药模型通用的基础技术规范，可根据实验需求及不同成瘾性物质进行相应的剂量和操作的调整。4.2.2.1 自身给药训练将静脉插管术（具体操作见附录）后恢复的实验动物提前Ih放置自身给药装置操作间进行实验环境的预适应。之后将实验动物放置于自身给药训
12、练箱中，进行训练。a）实验程序启动时笼灯亮而有效压杆或鼻触孔上方的信号灯灭。当实验动物踏有效压杆或触有效鼻触孔达到设定次数时，压杆或鼻触孔上方的信号灯亮520s,伴随注射泵的声音实验动物可获得一次药物的注射，之后将有1020s的不应期。当实验动物踏无效压杆或触无效鼻触孔时无任何反应。b）自身给药训练根据不同设定次数程序设置，分为固定比率训练程序（fixedratioschedule,FR）和累进比率程序（PrOgreSSiVeratioSChedule,PR）。c）固定比率训练程序（FR）是指实验动物得到一次药物注射所需要的固定的操作次数。如：FRl,压杆或鼻触1次获得1次药物注射；FR2,即
13、压杆或鼻触2次获得1次药物，以此类推。d）累进比率程序（progressiveratioschedule,PR）是指动物获得一次药物注射所需要进行的操作数不断地增加。每次获得药物的行为成倍数或指数级递增，如1,2,4,6,9,12,15,20,25,32,40,50,62,77,95,118,145,178,219,268,328,402,492,603等。e）在训练的前3天采用固定比率训练程序（fixedratioschedule*FR）使用0.1mg/kg/i.v.的甲基苯丙胺剂量进行FRl初始训练，每个训练时长为34h,注射上限可根据不同的成瘾性物质的毒性设置注射上限。f）初始训练之后换
14、成较低剂量的甲基苯丙胺（0.05mgkg,i.v.）进行FR2训练，训练周期通常为10天，此时实验动物的用药次数后3天的变化率10%,用药行为趋于稳定，可进行下一步实验。g）根据训练时间的长短可分为短时程用药和长时程用药。可根据实验目的需求进行相应的选择。h）短时程训练（shortaccess）,每天每次训练不大于2h,训练周期不多于25天。该训练模式反映了规律性用药特征，每天用药量无显著性的变化。i）长时程训练（extendedaccess或IOngaCCess）,每天每次训练不小于6h,训练周期为1520天；或延长训练周期（ProlOnged或extendedaccess）,每天每次训练3
15、h,训练周期50天以上。该训练模式反映了强迫性用药特征，动物用药行为呈现递增反应。j）当实验动物完成上述固定比例程序训练获得稳定的用药行为后，转换为PR训练，训练时长为6h,记录实验动物获得最后一次药物注射所需要付出的最大劳动力（压杆或鼻触次数），即断点（breakpoint）,断点反映动物为获得药物注射愿意付出的劳动强度的大小，可用于评价实验动物的动机行为和药物奖赏效能。4.2.2.2 消退训练a）当实验动物踏有效压杆或鼻触孔时与压无效压杆或鼻触孔一样，均无任何事件（如信号灯亮，药物注射，注射泵声等）发生。b）每天训练1次，每次34h,实验周期通常为2周，直至出现连续3天的有效鼻触数和无效鼻
16、触数均在10次以内则视作消退成功。4.2.2.3 点燃训练a）药物相关线索点燃：将完成消退的实验动物，放置自身给药训练箱中，当实验动物踏有效压杆或触有效鼻触孔时，将出现用药训练中相同的灯光线索，仍无药物注射，而实验动物踏无效压杆或触无效鼻触孔时，仍无任何事件的发生，在此过程中记录有效反应和无效反应。b）药物点燃：完成消退训练的实验动物，提前给予训练时使用的药物（如腹腔给予甲基苯丙胺lmgkg）,放置自身给药训练箱中，当实验动物踏有效压杆或触有效鼻触孔均无任何事件相应。根据实验目的的需求，可使用其他成瘾性物质进行诱导，记录有效反应和无效反应。c）应激点燃：通常采用足底电刺激和实物剥夺的方式进行诱
17、导。将上述完成消退训练的实验动物放入自身给药训练箱后，开启连续IOmin的足底电击（5s0.8mA电流刺激，IOs间隔），当实验动物踏有效压杆或触有效鼻触孔均无任何事件响应，记录实验动物的有效反应和无效反应。4.2.3 评价指标a）有效反应（如鼻触/压杆行为）发生的次数和频率。b）给药次数。4.3 条件性位置偏爱实验4.3.1 实验材料4.3.1.1 实验动物清洁级或更高等级的小鼠和大鼠作为实验动物。自由饮食，适应环境57天后开始实验。适用于成年雄性健康SD大鼠、WiStar大鼠、C57小鼠、昆明小鼠、ICR小鼠等。4.3.1.2 两箱式条件性位置偏爱箱a）由一个黑色和等大的白色箱体组成，黑色
18、箱体底部可为塑料光滑底板，白色箱体底部可用金属网；箱子顶部盖子上有灯光调节装置及视频追踪系统。b）左右两箱大小分别为大鼠：60cm40cm40cm,小鼠38cm17cm37cmoc）测试时将动物由黑色箱放入装置内。4.3.1.3 三箱式条件性位置偏爱箱a）由三个箱子组成，左右两侧分别为等大黑色、白色箱体，中间为灰色较小箱体，三个箱体间由小门连接，动物可以自由通过。b）一侧活动箱内侧墙壁为黑色，地板为铁质网格状，另一侧活动箱内侧墙壁为白色，地板为铁质条纹状。箱子顶部盖子上有灯光调节装置及视频追踪系统。C）大鼠实验左右两箱大小为60CmX40CmX40Cm,中间箱大小为40CmX6.5CmX60C
19、m,小鼠实验箱左右两箱大小分别为38CmXl7cmx37cm,中间箱大小为7cmxl7cmx37cm0三箱之间有小门可供实验动物在装置内自由穿梭，另配备40cm40cm大小的活动挡板可阻断三个活动箱。d）测试时将动物由中间箱放入装置内。4.3.1.4 视频追踪系统a）视频追踪系统由摄像系统和分析软件组成。b）位于每个实验箱顶部的摄像装置通过画面分割器与计算机连接，能够同步追踪实验动物在每个实验箱内的活动情况，并可摄像保存视频文件。c）采用动物行为分析软件，可获得实验动物在三箱内分别停留的时间、活动的路程以及穿梭次数。4.3.2 实验方法条件性位置偏爱实验分为三个阶段：4.3.2.1 基础值测试
20、期a）将实验动物置于CPP箱中，自由穿梭15min,连续3天，并在第3天记录实验动物在各箱体停留的时间、距离及穿梭次数。b）应剔除对任何箱体有明显偏好（停留时间多于67%总时间）或厌恶（停留时间少于33%总时间）的动物。43.2.2训练期a）采用非偏设计或有偏设计确定伴药箱。非偏设计：两侧箱体停留时间应无明显差异，基线结果约为360s370s,可随机选择一半的动物在给药后放入黑箱（即黑箱为伴药箱），给溶剂后放入白箱；另一半的动物在给药后放入白箱（即黑箱为伴药箱），给溶剂后放入白箱。有偏设计：如实验动物有偏好，宜采用有偏设计，即选择非偏好侧（停留时间更短侧）作为伴药箱。b）隔天训练方案：在第1、
21、3、5、7天给予动物成瘾性药物（如皮下注射盐酸吗啡），并在给药后立即将实验动物放置于伴药侧箱内，关闭小门，在箱内停留45min;在第2、4、6、8天给予等体积溶剂，并在给药后立即将实验动物放置于非伴药侧箱内，关闭小门，停留45mi11oC）连续训练方案：每日上午给药，并在给药后立即将实验动物放置在伴药侧箱体45min;隔8h后给与等体积溶媒，并在给药后立即将实验动物放置在非给药侧箱体45min;此流程连续重复34天。1.1.23 测试期将实验动物置于条件性位置偏爱箱中，自由穿梭15min,记录其在各箱体停留的时间、距离及穿梭次数。1.1.24 价指标a）CPP值：CPP值=伴药箱的停留时间-非
22、伴药箱停留时间。CPP值越高代表药物的奖赏效应越强。b）偏爱分值：伴药箱停留时间/（非伴药箱停留时间+伴药箱停留时间）X100%o偏爱分值越高代表药物的奖赏效应越强。C）穿梭次数：体现动物的自主活动性，用于排除由于动物的运动异常造成的CPP实验结果的偏差，穿梭次数不小于基础测试时的穿梭次数。4.4 辨别实验4.4.1 实验材料4.4.1.1 实验动物a）清洁级或更高等级的大鼠、小鼠作为造模动物。适用于成年雄性健康SD大鼠、Wistar大鼠、C57小鼠、昆明小鼠、ICR小鼠等。以下以SD大鼠为例进行说明。b）适应环境后，控制饮食，使其体重降为原体重的80%后，开始实验。4.4.1.2 实验装置a
23、）操作条件反射箱一般安放在通风、隔音、避光的外箱中。b）操作箱配备2个鼻触或压杆以及可以定量给予食物（颗粒食物或糖水）或药物的装置。c）将一个鼻触设为药物鼻触或药物1鼻触，另一个设为训练时的非药物鼻触或测试时的药物2鼻触。d）动物鼻触或压杆程序、行为反应模式、食物及药物分配的流程均由计算机控制。4.4.2 实验方法药物辨别实验包括起动训练（initialtraining）,辨别训练（discriminationtraining）和辨别测试三个阶段。4.4.2.1 起动训练a）此过程选用食物奖赏进行训练，以大麻接受Ih训练或得到100次食物强化为I个实验期，达到任何一个要求将终止实验，每天进行1
24、个实验期的行为训练。b）实验开始时笼灯关闭，训练箱内环境黑暗，左、右鼻触均为有效鼻触，橙色鼻触灯亮,在接收到鼻触感应器信号时熄灭两侧鼻触灯，点亮信号灯，启动食物泵，食物颗粒经导管进入食物槽中。c）鼻触后有20s不应期，不应期内的鼻触次数依然被记录，但是不会引起任何结果。d）不应期后，两侧鼻触灯再次亮起，笼灯熄灭，大鼠即可再次获得食物。e）大鼠在同一程序下连续2天在30min内获得100次食物，FR值可增加1次，训练程序由FRl逐渐递增至FRI0。f）当大鼠在FRlO程序下能够稳定获取食物颗粒，可进行辨别训练。4.4.2.2 辨别训练a）实验开始时笼灯关闭，训练箱内环境黑暗，控制软件中根据平衡设
25、计，设置一侧鼻触为药物相关有效鼻触，另一侧鼻触为生理盐水相关有效鼻触。b）注射药物或生理盐水时，相关的有效鼻触内橙色鼻触灯亮。c）在接收到有效鼻触感应器信号时熄灭鼻触灯，点亮信号灯，启动食物泵，食物（颗粒或糖水）经导管进入食物槽中。d）有效鼻触后有20s不应期，不应期内的鼻触次数依然被记录，但是不会引起任何结果。e）不应期后，有效鼻触灯再次亮起，笼灯熄灭，大鼠即可再次获得食物。f）采用重复交替训练法，即药物/药物/盐水/盐水/药物/药物/盐水/盐水.，训练前30min注射药物或生理盐水，以4个实验期为1个训练周期。g）观察每日训练的数据，并根据先前训练程序的数据调整训练参数。药物浓度增加并一直
26、维持在某个浓度。h）以大鼠在1个训练周期内反应正确率达80%以上为合格，FR值依次递增至FRl0,记录大鼠的反应正确率及反应速率。通常大麻药物辨别刺激的获得需要十几个到几十个训练周期。i）当FR值增至10,大鼠连续2个训练周期有效鼻触率80%时，能够稳定辨别一定浓度甲基苯丙胺或海洛因与生理盐水后，进入药物辨别测试阶段。4.4.23辨别测试a）采用替代试验（substitutetest）进行辨别测试。b）分别给予不同剂量的药物（一般为四个剂量）和其它待测新精神活性物质进行替代试验。c）在替代试验中，左右鼻触均为有效鼻触，测试程序FRI0,记录建立稳定的药物辨别行为需要的训练时间、辨别准确度。d）
27、大鼠给予一个剂量测试完成后，重新FRlo训练，待测试合格后进行下一个剂量测试。4.4.3 评价指标4.4.3.1 辨别训练a）辨别训练合格的评价标准：采用FRlO训练程序时，合格大鼠评定标准为：A.鼻触正确率大于80%；B.每个训练周期第一次训练中错误鼻触数低于5。b）连续2个训练周期达到上述要求，说明大鼠已经具备药物与非药物的辨别能力，可以进行测试。4.4.3.2 替代实验的评价指标：a）药物辨别行为形成的速率，达标时间的长短。衡量药物辨别刺激的效应强度。b）每个训练期的首次鼻触正确率。反映动物感受药物精神效应的能力以及作出适当反应的能力。首次鼻触反应正确率越高，说明药物的主观效应越强。c）
28、药物辨别动物鼻触反应正确率：若反应正确率大于80%,说明受试药物与训练药物的药理作用特点极其相似，受试药物可以完全替代训练药物；若反应正确率在20%80%之间，说明受试药物与训练药物的药理作用特点可能存在相似之处，受试药物可以部分替代训练药物；若反应正确率低于20%,说明受试药物难以产生训练药物的鉴别行为反应，其药理作用特点不同于训练药物，受试药物不能替代训练药物，不产生与训练药物类似的主观效应。4.5 敏化实验4.5.1 实验材料4.5.1.1 实验动物a)采用清洁级或更高等级的成年雄性健康C57小鼠、昆明小鼠、WiStar大鼠和SD大鼠等。b)实验动物自由饮食、适应饲养环境57天后可进入实
29、验流程。4.5.1.2 实验装置a)实验装置可采用旷场实验测试箱，底板颜色与实验动物身体颜色需形成鲜明区分。b)测试箱大小分别为小鼠测试箱大小50CmX50CmX40Cm,大鼠测试箱IoOemXloocm40Cmoc)实验环境应控制噪音(45dB60dB)、光强度(401uxIoolUX)、温度(21C27C)和湿度(40%60%)等因素基本稳定。4.5.1.3 视频追踪系统a)视频追踪系统由摄像系统和分析软件组成。b)摄像头需位于测试箱中心正上方100Cm150cm,摄像装置通过画面分割器与计算机连接能够同步追踪实验动物在每个实验箱内的活动情况，并可摄像保存视频文件。c)采用动物行为分析软件
30、，可获得实验动物在测试箱内的活动路程、速度、停留时间和异常行为。4.5.1.4 实验药品甲基苯丙胺、可卡因、吗啡、尼古丁等具有精神兴奋效应的成瘾物质。4.5.2 实验方法行为敏化实验分为形成期(development)、转化期(transfer)和表达期(expression)三个阶段：4.5.2.1 形成期a)实验前12天，实验动物应进行实验环境适应和测试箱空载实验12次。b)动物由饲养室转运至测试间需适应环境1530min给药方式：静脉注射、腹腔注射，灌胃等。给药频次：每天1次。给药剂量：表达期剂量的12倍，如甲基苯丙胺Iomg7kg、吗啡IOmgkg等。c）甲基苯丙胺、吗啡和可卡因等精神
31、兴奋效应较强的成瘾物质建议给药15天，以生理盐水为对照物质。d）每次测试时间应不少于所给成瘾物质的1/2个血浆半衰期（如，甲基苯丙胺30Omin、吗啡24Omin）。e）动物给药后立即放入测试箱，视频追踪系统记录动物的自主活动以及刻板行为和异常姿势评估。每次测试时间应不少于所给成瘾物质的1/2个血浆半衰期（如甲基苯丙胺30Omin、吗啡24Omin）。f）测试结束后动物转回饲养室，正常饲养。4.5.2.2 转化期一般为37天，实验动物正常饲养，停止成瘾物质给药（停药期可以促使实验动物对成瘾物质的高活动性转化为行为敏化）。4.5.2.3 表达期a）动物由饲养室转运至测试间适应环境1530minb）动物给予1次121倍形成期剂量的成瘾性药物（如，甲基苯丙胺5mgkg、吗啡5mgkg）进行激发试验（challengetest）oc）同4.5.2.1e。4.5.3 评价指标4.5.3.1 自主活动评价指标为自主活动总距离、运动速度和停留时间等。4.53.2刻板行为和异常姿势。人工记录实验动物跳跃和刻板行为次数等。
