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1、最新综合医院结核分枝杆菌感染实验室检查共识结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)是经典致病菌,引起肺结核和肺外感染。结核病是目前全球感染性疾病死亡的主要原因。我国是结核病大国，初诊患者很多在综合医院就诊，但结核病在综合医院的病原学诊断、药敏试验等却不尽如人意。中国医疗保健国际交流促进会临床微生物与感染分会、中华医学会检验医学分会临床微生物学组、中华医学会微生物学和免疫学分会临床微生物学组组织专家撰写本共识，供综合医院结核病病原学检查参考。一、术语(给核分枝杆菌复合群Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)该菌是细长、直或稍
2、弯曲、两端圆钝的杆菌，长约14m,宽约0.30.6m,抗酸染色阳性，可致结核病。结核分枝杆菌复合群包括MTBx牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡内蒂分枝杆菌和田鼠分枝杆菌等。非结核分枝杆菌(non-tuberculousmycobacteria,NTM)是指分枝杆菌属中除结核分枝杆菌复合群及麻风分枝杆菌以外的菌种。(二)活动性结核病MTBC感染人体后，处于活动期，患者有结核病相关的临床症状和体征,有MTB感染的病原学、病理学、影像学等检查证据。()潜伏性结核感染(latenttuberculosisinfection,LTBI)机体感染MTBC后出现持久免疫应答但未发生活动性结核病的一种临床状态，临
3、床上既无活动性结核病的症状、体征和明显的实验室检查异常，也无活动性结核病的影像学证据等。目前尚无公认的LTBl诊断方法。(四)肺外结核病结核病变发生在肺脏以外的器官和部位，可能伴/不伴非特异性全身症状。如淋巴结、骨、关节、泌尿生殖系统、消化系统、中枢神经系统等部位。(五)多重耐药结核病(multidrugresistanttuberculosiszMDR-TB)MTB领域指该菌同时对异烟月井和利福平耐药。该菌所致疾病为MDR-TBe(六)广泛耐药结核病(extensivelydrug-resistanttuberculosis,XDR-TB)MTB领域指该菌对利福平和任何氟唾诺酮类药物以及贝达
4、奎林和利奈嘤胺中的一种具有耐药性。该菌所致疾病为XDR-TBo(七)准广泛耐药结核病(pre-extensivelydrug-resistanttuberculosis,pre-XDR-TB)MTB领域指该菌对利福平和任何氟瞳诺酮类耐药。二、目的与适用范围()目的鼓励综合医院开展结核病的病原学检查，规范结核病实验室诊断和鉴别诊断，提高综合医院结核病诊、治、防、控能力。(二)适用范围对咳嗽、咳痰2周或2周以上，或痰中带血或咯血，或依据流行病学史、临床症状、影像学特征等，疑为结核病或需要排除结核病时，应开展结核病病原学检查。对病原学阳性患者的密切接触者、人类免疫缺陷病毒感染者/艾滋病患者、透析或移
5、植患者、硅肺患者等重点人群的主动筛查。接受免疫抑制疗法的患者，如肿瘤坏死因子媚抗剂、系统性皮质类固醇或器官移植后使用免疫抑制剂等，应开展结核病和潜伏性结核感染的筛查与监测随访。本共识所列MTB实验室检测项目的相关建议适用于综合医院。结核病医院、收治结核病的感染病医院/传染病医院之外的其他专科医院，如果涉及结核病，可以参考本共识。三、中国结核病流行病学和综合医院在结核病微生物学诊断中的定位(一)结核病面临的挑战结核病是由MTB感染引起的重要传染病，患病率高，社会负担重。MTB进入人体会引发以细胞免疫为主的免疫反应和迟发性变态反应，造成慢性炎症、干酪样坏死和空洞形成的病理改变，进展缓慢。肺结核的主
6、要临床症状为咳嗽、体重减轻、盗汗、低热等，也可以无明显症状，隐匿起病；肺外结核的临床表现还有相应受累局部的炎症病变。2021年世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)全球结核病报告显示，2020年全球估算新增结核病病例约990万，每10万人中约有127例患病1o30个结核病高负担国家占全球所有估算病例的86%,前3位国家为印度(26%)、中国8.5%地印回8.4%X2020年中国估算发病数84万，发病率59/10万。2020年中国登记的人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)感染者中结核阳性率1.4%,HIV阳性结核病发病数
7、1.2万，实验室确诊的MDR-TB和利福平耐药结核病(rifampicin-resistanttuberculosis,RR-TB)患者1.6万zpre-XDR-TB和XDR-TB患者1.2万。2020年，新型冠状病毒肺炎疫情影响全球结核病防控。全球用于结核病预防、诊断和治疗服务的费用下降9%WHO预计结核病作为单一传染病死亡原因从2019年第1位降至2020年第2位。(二)综合医院是发现结核病的主要场所和前哨结核病患者常常以呼吸道疾病表现为主，估计有超过50%的结核感染者到综合医院首诊就医。建设综合医院结核病检测能力是提升结核病防治水平的首要任务。及时发现结核感染者，控制传染源是结核病防治工
8、作的起点2,而结核病的临床实验室检测是诊断该病的重要支撑。结核病防治体系中传染病专科医院集中收治结核病患者，而综合医院已成为发现结核病的主要场所和前哨3。WHO全球结核病报告显示,2020年全球病原学阳性证据率为58%而我国登记的结核病数据显示2020年诊断结核病时55%的患者具有病原学阳性证据4z比例低于全球水平，误诊和漏诊并不少见。另一方面，结核病的实验室诊断技术不断进步，从传统抗酸染色、MTB培养、体外药敏等经典细菌学检查发展成包括结核免疫学、分子生物学检测及结核病辅助检测等多方面的结核病临床检验体系，同时从手工到自动化，从定性到定量的变革，使综合医院可根据自身能力开展和优化结核病检测工
9、作5L为健康中国20302035终止结核流行目标提供保障。四、结核病实验室检查方法与结果解释结核病实验室检查方法按方法学分类包括以下3种。(1)病原学诊断方法：如涂片显微镜检查与培养；(2)免疫学诊断试验：如结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest,TST)、结核抗体检测与Y-干扰素释放试验(interferon-releaseassay,IGRA);(3)分子生物学方法。其中，培养与分子生物学方法可用于结核病确诊。(一)涂片显微镜检查用于涂片显微镜检查的临床标本，包括但不限于呼吸道标本（痰、咽喉拭子、支气管肺泡灌洗液、支气管毛刷等）、胸腔积液、腹腔积液、尿液、脑脊液、胃液、脓液
10、（分泌物、穿刺液等）、穿刺物、病理组织、粪便等。对于痰标本，采用5%次氯酸钠液化后离心浓缩，沉淀物涂片染色可有效增加阳性率，对于未采用分子生物学或培养等手段的实验室非常重要。对于体液标本，含有的MTBC的数量很少，涂片本身价值非常有限，一般推荐浓缩后涂片。但是浓缩过程存在生物安全风险,且MTBC的比重与水相近,有一部分MTBC会存在于上清液中，离心未必有效提高检出率。因此在实验室有条件时应尽可能采用更灵敏的手段进行MTBC检测。目前较为实际的方法是，对肉眼所见清亮的体液标本，优选细胞离心甩片机浓缩制片，也可使用普通离心机。对于脑脊液，标本量充足时建议至少用5ml标本。当标本混浊、血性或脓性，可
11、直接涂片不离心。浓缩的标本在进行半定量报告时，建议备注为浓缩标本。胸腔积液时，优选胸腔活检组织用于MTBC微生物学检查。1 .萋-尼抗酸染色和显微镜检查：该方法采用萋-尼抗酸染色液对临床标本涂片染色后，用普通光学显微镜或发光二极管显微镜进行观察。2 .荧光染色和显微镜检查：该方法利用金胺0染料对抗酸杆菌进行染色。该方法阅片时间较短，一般为13min,可减轻工作强度。荧光染色后的标本要立即观察，否则应将玻片标本置于28。（:黑暗中以减少淬灭对结果的影响。结果分级报告标准见表1。1分枝杆菌姜-尼染色与荧光染色镜检结果分级报告标准顼目安尼染色a显微境量？弯信慢蝌=O(呗野.未发瞅该杆苞网50视野阳性
12、(报告分枝杆苞敢)1幽300嬷1-/50521*3瞭/100视野,在彘嫁30MWy109g50W2+9(iW.:察100ZrW3+1幽1财1O951W4*owIooStRUltZiW注：ajg溺。娴30(rlW,侬2+期观察10(r三?.3+、4+时粉观察5办网.中印J.Jgej三ik述.Tifies(in：题女丝状似四体等).我实际观察清况捅西6三结果.四a：曼尼染色问锚尤体(2+).bS告2+至少旗5S嬷.3+及以上的冏丝三果至少观察2(T?视野涂片镜检具有操作简单、检测迅速、对硬件设施要求不高等优点，适合基层开展。但该方法敏感度较低，特别是儿童、艾滋病与肺外结核病患者6z7oTan等8以
13、BDMGIT液体培养和/或XpertMTB/RIF分子生物学方法作为MTBC检测金标准，评估了自动涂片显微镜检查技术(自动系统)的敏感度和特异度。结果自动系统检出率为28.2%(150/496),明显高于人工涂片镜检21.1%(111/496zP0.01)。190份阳性标本中，自动系统检出140份阳性，敏感度为73.7%,明显高于人工涂片镜检55.3%(P4KXD6理唬的IFNia短S皮肤侬大小签乳利与活动性结嗯襁襁襁磁恬的Ei8运程襁罹NTMXXfiSW5WSrB.55KH.tKW5?Sff.苏氏分败杆:三三斯分校汗K.ftSB分冲NTM灰肝!然凝全血ffiK!11ls.asm无出恸原SAT
14、-6CEFlO6SAT-6c三-o2om三g分校杼普?!包staan(h)24824M848-72献码实16宦条件妻求11较假囹MadB相对较大而更道用于先行秀学禹杳和一点人群苒守若8HrteDItmatt三grs注：TST力eM*S5帙磁.LTBI力帮伏姑嗜分5样.CDjWWStteLIFN为干扰JLMTM力3B矽技杆亚ESAT6为SW分泌相E,CEF-1018美B尊自10上述释放Y-干扰素水平和释放YzF扰素效应T淋巴细胞数量两方法对诊断活动性结核病的综合敏感度和特异度报道不一，约为80%(95%CI75%84%)/79%(95%CI75%82%)和81%(95%CI78%84%)/59%
15、(95%CI56%62%)。约20%的活动性结核病患者IGRA为阴性13。IGRA在健康人群中阴性预测值较高，而HlV感染人群则较低。在结核低发病率国家，有超过50%的HIV感染者进行2种试验方法均为阴性,而后来发展为活动性结核病。IGRA对进展为结核病的预测能力并不优于TSTo释放肝扰素水平增高，或释放斤扰素效应T淋巴细胞数量增加，也不意味着发展为活动性结核病的风险就更大。IGRA阳性值水平与罹患结核病的风险之间不具有相关性。不同免疫状况的人群中，IGRA阳性未来罹患活动性结核病的风险存在差异。IGRA数值的变化与治疗效果之间未发现明确的相关性13。5岁以上免疫功能正常的个体，IGRA对于结
16、核病的检测敏感度常优于TST,尤其是已接种卡介苗的人群。与此相反，对于小于5岁免疫功能正常的个体JGRA敏感度常不如TST。对于免疫功能受损的个体JGRA与TST的敏感度均低于健康人群，前者优于后者，且患者的免疫状况对IGRA的释放斤扰素效应T淋巴细胞数量影响较小。对免疫功能低下的高危人群，依次或同时使用IGRA和TST,可提高结核病和潜伏感染者的敏感度，任何一个阳性均可能有临床指导意义。除了辅助结核病的诊断JGRA也广泛用于在高危人群排除活动性结核病后定义潜伏感染，指导结核病预防性治疗。如HIV/AIDS.实体器官移植、硅肺、慢性肾功能衰竭/透析、激素应用等患者,LTBI活化为活动性结核病的
17、几率增加。止匕外，近年来随着生物制剂在中国不断广泛应用，明显改善了免疫性疾病患者的临床进程及预后，改善了患者的生活质量。但与此同时，用药安全性的问题也愈发受到重视。对此类人群除了排除活动性结核病外，还应进行IGRA的检测或监测，必要时采用抗结核药物预防活动性结核病14共识4:建议IGRA用于结核感染的诊断。该检查不能区分潜伏感染、活动性结核、陈旧结核。辅助诊断活动性结核病时，须结合临床表现、影像学、检验医学等综合判断分析，不能作为单独或是决定性的结核病确诊依据。共识5:对于需要接受各类免疫抑制治疗的IGRA阳性患者，原因确定前，须慎重实施免疫抑制治疗，警惕结核感染风险。5岁以上免疫正常人群进行
18、IGRA检查，结果阴性常可排除活动性结核，但免疫系统功能不全、有基础疾病的情况应结合临床。共识6不建议将IGRA用于疗效监测。在治疗活动性结核过程中JGRA数值变化幅度不反映抗结核疗效。结核病治愈患者IGRA可阳性。共识7:无结核病风险的人群，不建议常规筛查IGRA或TSTo对生物制剂(如肿瘤坏死因子拮抗剂)治疗的患者，建议采用IGRA进行下呼吸道MTB感染的筛查与监测随访。共识8:对于卡介苗接种人群结核感染的特异度，IGRA常优于TST,但与接种策略有关。共识9:部分NTM感染人群，存在的交叉抗原可致IGRA阳性。共识10：不建议将结核抗体检测用于结核病诊断，不建议实验室开展该检测。(三)病
19、原学检测1.MTB培养：作为结核病诊断金标准，分枝杆菌培养是结核病诊治的重要检测手段。通过培养获得的菌株可用于后续的药敏检测、基因测序、进化分析等。目前培养方法最低检出限约为10100CFUm15,固体培养敏感度约为67%,BactecMGIT960敏感度约80%,特异度均约98%,高于抗酸染色16,17。MTBC生长缓慢，因此对有菌部位来源的标本和培养过程均需去污染处理。注意去污染对MTBC生长亦有影响18,19固体培养可能有2%5%的污染率。污染率超过5%时，可提高前处理中NaOH的浓度至4%18o过低的污染率可能有去污染处理过度的可能，会降低阳性检出率，增加检出时间20。降低污染率的措施
20、常包括延长NaoH作用时间、小幅度增加NaOH浓度、增加N-乙酰-L-半胱氨酸浓度等，但改变前处理方法时需评估，以免影响MTBC生长。液体培养方案中采集的标本包括非无菌标本和无菌体液标本。非无菌标本主要指痰液，以及其他有菌部位标本，如脓液、胃引流液、支气管灌洗液、喉部拭子、开放伤口组织、尿液等。无菌体液标本包括血液、胸腔积液、腹腔积液、关节炎、脑脊液等。BactecMGIT960系统对非无菌标本和无菌体液标本均适用。BactecFX血培养系统和VersaTREK培养系统适用于无菌体液标本。BactecMGIT960液体培养基中含有特殊复合物，随着培养基中分枝杆菌的生长，氧气消耗，复合物荧光增强
21、，从而监测分枝杆菌生长。通常，液体培养基加入复合抗生素抑制杂菌。MTBC在液体培养基中生长呈颗粒状聚集。液体培养基中促MTBC生长的营养因子更为丰富，因此培养阳性率比固体培养高约10%21z且检测时限更短(约14d)22,但同时污染率也升高(7%8%)。固体培养是目前较为成熟的分离培养方法，对结核菌分离效果较好，但对NTM分离效果不佳,有各种改良方法供NTM培养使用。固体培养时间较长，培养菌可直接用于药敏检测。液体培养因其快速、自动化的特点为实验室初次分离和传代培养的最常用方法。通常认为要更好地分离结核菌，可使用液体培养联合一种或多种固体培养方法，但会增加实验成本。通常实验室根据自身条件、操作
22、习惯、工作量等因素，选择培养方式并进行优化。无论液体培养还是固体培养，培养物都需要经过抗酸染色证实。抗酸阳性标本可以通过胶体金方法检测结核抗原一一结核分枝杆菌蛋白64(MPT64)、荧光定量扩增结核特异基因检测、基质辅助激光解析电离时间飞行质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOFMS)检测或对硝基苯甲酸(P-nitrobenzoicacid,PNB)生长试验法进一步区分MTBC和NTMoMPT64为MTBC早期分泌的特异蛋白，可作为MTBC的鉴定指示，敏感度和特异度约
23、为98.5%和100.0%23o荧光定量扩增结核特异性基因检测可区分MTBC和NTM,敏感度和特异度约为97.0%和98.9%MALDI-TOF质谱鉴定技术对抗酸阳性培养物可鉴定到种水平，总体鉴定率大于99%24z但前处理过程尚需标准化。PNB生长试验为分枝杆菌属初步分型的传统生化反应,与睡吩-2-竣酸胧(2-thiophenecarborylicacidhydrazide,TCH)生长试验配合，用于抗酸阳性培养物以及人型、牛型MTB的鉴定。该方法检测MTBC的敏感度和特异度分别为100.0%和96.9%23o共识11：为更好分离MTBC7实验室可根据自身条件，选择固体培养和/或液体培养。固体
24、培养孵育至少8周，液体培养孵育至少6周，方可报告阴性培养结果。MTB属于高致病性病原微生物，分离培养须在风险评估后，并采取相应的防护措施后进行操作。共识12:培养阳性时，建议进行抗酸染色镜检，以确认培养物是否为抗酸染色阳性。抗酸染色阳性者建议报告抗酸菌生长,而不是MTBC生长。条件具备时进行菌种鉴定。2.分子生物学方法：WS288-2017肺结核诊断标准增加了分子生物学检查检测出MTBC核酸作为确诊依据之一25。美国CDC建议在怀疑MTBC感染患者中，将MTBC核酸扩增试验(nucleicacidamplificationtest,NAAT)作为初始检测手段26o分子生物学方法可在2h内得到结
25、果，相比传统培养方法明显缩短了检测时间，提高了敏感度和特异度。同时，分子生物学方法可进行菌种鉴定和耐药基因检测，利于结核病的快速诊断和及时治疗。目前实验室开展的分子生物学检测包括实时荧光定量聚合酶链反应、GeneXpertMTBRIFx线性探针分析（line-probeassays,LPA）以及恒温扩增技术等，主要靶标为MTB基因组中保守的管家基因（如rpoBx16srRNA和IS6110）o实时荧光定量PCR:实时荧光定量PCR技术的原理主要是通过荧光基团标记的特异性探针（Taqman探针或分子信标）对基因扩增产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，并结合相应软件对产物进行分析25。检测靶基
26、因常为IS6110,可检测临床各类型标本，包括痰液及肺外结核标本，针对实验室在用试剂盒适用范围外的标本类型，应进行性能验证。常用核酸提取方法包括热裂解、手动提取和核酸提取全自动设备。结果阳性表示标本中含有MTBC,检测限约为100CFU/ml,对结核检测的敏感度为64%81%,特异度为95%96%27该技术的开展需实验室严格分区，并做好实验室分子诊断试剂耗材的质控，定期采取有效的防污染措施，保证检测质量。实时荧光定量PCR所需设备及试剂成本较低，但无法同时检测利福平耐药突变。XpertMTB/RIF:XpertMTB/RIF基于半巢式PCR反应，通过荧光标记探针检测信号，扩增rpoB基因上的利
27、福平耐药决定区域（81bp）o该方法通过超声裂解和微流体技术将核酸提取、扩增及检测集成在一个反应盒，整个过程在封闭系统中完成，可进行标本直接检测，具有快捷性、易操作性和安全性。该方法具有较高的检测敏感度和特异度，最低检测限约为131CFUml25oWHO多中心研究表明该方法在肺结核检测中总敏感度和总特异度为88%和99%,在淋巴结、脑脊液中的敏感度和特异度分别为85%、92.5%和79.5%、98.6%,在胸腔积液中的敏感度较低(43.7%)28oWHO建议对于怀疑肺结核感染的成人和儿童、MDR-TB感染或HIV共感染人群/pertMTB/RIF应作为初始检测。对肺外结核，XpertMTB/R
28、IF检测淋巴结和脑脊液效果良好，对胸腔积液须结合其他项目综合判断。在利福平耐药性检测性能上，XpertMTB/RIF敏感度和特异度为95%和98%28o线性探针分析：该方法为WHO推荐的方法之一21,可用于临床标本和培养物中分枝杆菌菌种鉴定以及利福平和异烟月井耐药突变检测。LPA具有高检测通量的优势，以培养法为基础，使用线性探针检测培养物的敏感度95%,对利福平和异烟脱耐药性检测敏感度约为97%和85%29o恒温扩增技术：该类技术敏感度高、仪器要求低，易实现POCT化。主要包括环介导等温扩增(IooP-mediatedisothermalamplification,LAMP)、交叉引物恒温扩增
29、(crossprimingisothermalamplification,CPA)等。一项Meta分析显示LAMP应用于呼吸道标本MTBC的检测敏感度和特异度为89.6%和94%30oCPA检测位点为MTBC的6110。通过特异性扩增引物、荧光探针以及链置换特性的DNA聚合酶,在恒定温度条件下一次性完成MTBC检测。恒温扩增技术可用于结核病RNA检测。它利用靶标RNA在逆转录酶作用下合成双链DNA,T7RNA聚合酶以这条双链DNA为模板进行1：100-1OOO倍的转录，转录出RNA与分子信标结合发出荧光，实现高效扩增。因逆转录、转录和检测同时进行，故称同时扩增检测法(simultaneousa
30、mplificationandtesting,SAT)。综上，实验室可根据条件开展分子检测。实时荧光定量PCR方法具有良好敏感度和特异度，且设备及试剂成本较低，易于基层医院开展，推荐实验室作为首选方法。XpertMTB/RIF敏感度和特异度均优于实时荧光定量PCR,操作更为简单、安全、快速，不需要实验室严格分区，同时可检测利福平耐药，但检测成本较高，推荐具有条件的实验室可开展此项检测。LPA操作复杂、耗时较长，易污染，需要一定的技术积累，但可同时检测利福平、异烟月井耐药，适用于有经验的实验室开展。恒温扩增方法对检测环境和条件的要求低，可作为结核病实时检查项目。此外，高通量测序在结核病检测中也有
31、应用31,32,33,34。共识13:分子生物学方法具有较高的敏感度和特异度，能有效缩短MTBC鉴定和耐药性检测的时间。条件具备，建议进行分子生物学检测。共识14:分子生物学检测阳性时，如果患者临床症状相符，建议考虑结核病诊断。分子生物学检测中可能出现假阳性，在排除核酸污染的情况下，多由标本中死亡的MTBC核酸片段引起。共识15:多次分子生物学检测阴性，而抗酸染色或培养为阳性时，建议考虑包括NTM、诺卡菌等在内的抗酸阳性菌感染。分子生物学检测阴性时，不能排除结核感染。（四）药物敏感性试验表型药敏试验是MTB药物敏感性的金标准。根据WHO指南，开展MTB表型药敏试验最基本的检测药物应包括：利福平
32、、异烟脱、乙胺丁醇和口比嗪酰胺；对于MDR-TB和RR-TB,优先推荐在4种药物基础上加做贝达瞳琳、利奈嗖胺、氟喳诺酮类药物（左氧氟沙星或莫西沙星）；可选做氯法齐明、环丝氨酸、阿米卡星、链霉素、乙硫异烟胺和对氨基水杨酸。国内常用的表型药敏检测方法分为比例法（固体）、绝对浓度法（固体）、液体法和最低抑菌浓度法（minimuminhibitoryconcentrationzMIC）固体药物敏感试验简单、经济，不需要特殊仪器，易于推广，但耗时较久，便于标本量较小的实验室开展19。美国食品药品监督管理局在2002年批准BACTECMGITTM960法用于MTB对链霉素、异烟月井、利福平、乙胺丁醇和叱嗪
33、酰胺的药物敏感试验，该方法在阳性检出率和培养时间上具有明显优势，缩短了结果报告时间，操作简便，具备相应条件的实验室优先推荐。WHO还推荐液体法对贝达瞳琳、利奈嗖胺、氯法齐明和德拉马尼这类新型抗结核药物进行药物敏感试验35最低抑菌浓度法操作简便，且体积小，适用于标本量较大的实验室。分子生物学方法可以对MTB的药物敏感性进行快速检测。对于没有条件开展表型药敏试验的综合医院，分子药物敏感性试验可作为补充方法。目前，临床运用非常广泛的XpertMTB/RIF同时检测MTB和利福平耐药的方法。其操作简便，结果报告时间短，适用于综合医院开展。对于有XpertMTB/RIF检测平台的实验室,推荐使用,可用于
34、对RR-TB进行筛查。国内已有基于荧光PCR熔解曲线法检测MTB对利福平、异烟脱、乙胺丁醇、链霉素和氟瞳诺酮类耐药突变的试剂盒，该技术较为方便、快捷，检测时间短，且有自动判读结果的软件，因此较适用于临床推广36对于合并其他感染或临床诊疗不理想时，可采用测序技术作为补充。WHO于2021年6月发布了MTBC耐药突变目录，有助于解释MTB耐药基因突变与耐药性的关联37。共识16:进行表型药敏试验时，建议实验室满足加强型生物安全二级要求。方法涉及活菌时，操作须严格遵守生物安全要求。共识17:固体比例法是检测除口比嗪酰胺以外其他抗结核药物敏感性试验的参考方法，在符合生物安全条件的情况下，建议开展表型药
35、敏试验。共识18:表型药敏试验为金标准方法，分子药物敏感性试验可作为补充方法。建议综合医院优先采用分子药物敏感性试验。建议使用复杂度低、自动化程度高的分子药物敏感性试验检测方法。（五）生物安全、质量控制与临床会诊1 .生物安全：由于MTB主要通过呼吸道传播，有效控制气溶胶产生可以增加生物安全性。个人防护推荐N95口罩、一次性隔离衣、酌情佩戴护目镜38。开展项目前应做好生物安全风险评估。共识19:建议实验室根据自身生物安全条件选择适合实验室的项目。分子检测及涂片抗酸染色检测应在生物安全二级实验室开展，培养及表型药敏必须在加强型生物安全二级实验室开展。共识20:条件有限无法完全满足要求的实验室，在
36、生物安全风险评估基础上，建议通过强化防护意识、提高个人防护措施、规范防护行为等方式减少生物安全风险。共识21:MTB的培养和表型药敏检测开展实验室间比对时，标本的运输应满足可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定要求。2 .质量控制：实验室对开展的MTB的检测方法都应建立完整的质量控制体系，包括人员、设施、环境条件、实验室设备、试剂、耗材、检验前过程、检验过程、检验后过程及结果报告。同时，应制定详细的室内质量控制程序，对于分子生物学检测方法，应有针对核酸检测防污染的具体措施。对每一项针对MTBC检测方法,实验室也都应开展室间质评。如无法参与则可采用实验室间比对方式来保证实验室
37、检测质量。对每一批次的新试剂都需要进行验证，验证结果合格才可以进行临床标本检测。此外实验室还应针对MTBC细菌学检测项目进行监测，监测内容应包括但不限于：标本总量、涂片阳性培养阳性数/率、涂阴培阴数/率、培养阳性标本中MTB和非结核分枝杆菌数量及所占比率、平均培养阳性时间、污染率、阴性质控等。这些监测指标应在实验室设置的范围内保持相对稳定。实验室监测指标中涂片阳性培养阳性率应在90%以39o另外良好的环境控制（如生物安全柜性能保证、培养箱温湿度的保证等）和人员培训及人员比对等都是保证实验室检测质量的重要措施。共识22:实验室对每一项MTB的检测方法都应开展室内质控,参与室间质评；没有质控时，须
38、完成实验室间比对。没有质控、没有比对，或质控不合格、比对不合格时，不建议开展相应检测，不能发出报告。3 .临床会诊：建议医务部门、相应临床科室安排涉及MTBC微生物学检查或结核病等会诊工作时，邀请临床微生物学同事参与。建议微生物学实验室工作人员参与临床会诊。参与人员名单在医务部门提前备案。参与人员是实验室资深同事即可，不必拘泥于是否有临床医师执照。参与后对微生物学检查结果（涂片、培养、IGRA、分子生物学检查、药物敏感性试验等）进行解释，对结核病和LTBl进行判断，对进一步处置给出建议。五、总结与展望目前，MTBC培养仍是诊断结核病、药物敏感性检测所必需，且为金标准。对于没有条件开展MTBC培
39、养的综合医院，应开展MTB检测的分子生物学技术，可优先使用自动化程度高的分子检测方法。Maldi-TOF-MS在分枝杆菌的鉴定上也有较好应用前景,但其临床应用价值还是主要依赖于其数据库的建立40,41,42,对于有相应平台的综合医院可将其用于分枝杆菌鉴定；XpertMTB/RIFUltra在国外已获得批准用于临床检测，提高了MTB的检测敏感度，特别是在检测脑脊液、胸腔积液等肺外结核标本43z44,在未来也有望给综合医院提供新的诊断工具。二代测序技术和全基因组测序技术在结核病检测方面还面临一些挑战45,46,47o如何将新型结核病实验室诊断技术真正应用于临床，值得关注。目前，很多新型技术还未获得医疗器械注册证。此外，实验室自建检测今后也将是MTB实验室诊断的方向。在MTB药物敏感性检测方面，分子药物敏感试验的应用范围会越来越广，除了基于PCR的各种分子药物敏感检测技术外，核酸质谱技术检测MTB对抗结核药物的耐药性也将得到很好地应用，特别是基于纯培养的全基因组测序技术在MTB分子药物敏感检测方面更具有临床应用价值。综合医院应利用现有的实验室平台及条件，在做好生物安全防护的基础上，努力做到MTB不漏检、不错检。对于有条件的综合医院，建议开展分子生物学检查和药物敏感性检测。
