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1、团体标准鸡传染性支气管炎病毒荧光重组酶介导等温扩增检测方法(征求意见稿)编制说明一、项目背景、来源及目的1、项目背景鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus,IBV)引起的一种急性高度接触传染性呼吸道疾病。IB可感染不同日龄、性别、品种鸡，导致鸡死亡以及增重、产蛋量、蛋品质和饲料报酬率等降低，同时还常常引起支原体、大肠杆菌病等细菌病的继发感染，从而使鸡群的死亡率增加，给全世界养禽业生产带来严重经济损失。IBV非常容易发生变异，导致新基因型甚至血清型不断出现，不同基因型或血清型之间交叉保护有限，给
2、该病防控带来极大困难和挑战，因此做好IB的防控具有非常重要的现实意义。而快速、灵敏、特异的病原检测方法是有效防控的前提和基础。中国是世界养禽大国，广西养禽业在中国处于领先位置。同时，广西是目前全球最大的地方优质鸡产区及主要消费地。地方优质鸡产业对农业产值的贡献率在逐年提高，是广西优势特色农业产业之一，是广西畜牧产业的支柱产业，同时也是农民现金收入的重要来源，对巩固脱贫攻坚成果和推动村振兴建设具有非常重要的现实意义。本课题组常年对广西地区IBV进行流行病学调查，发现IBV在广西规模化养鸡场鸡群中感染比较严重，给广西养殖场造成了重大的经济损失。此外，2020年9月14日，我国海关总署发布了关于进口
3、法国种禽种蛋检疫和卫生要求的公告(海关总署公告2020年第106号)，将鸡传染性支气管炎病毒列入检疫的疾病范围，也反映了该病防制的重要性。因此为了养禽业健康发展，迫切需要快速、灵敏、特异IBV检测方法。目前IBV的分子生物学检测方法主要是RT-PCR和实时荧光定量PCR,但这两种方法耗时长，且需要专门的仪器设备和专业的研究人员，不适用于临床快速诊断及基层推广使用。因此，有必要建立一种快速、特异性强、敏感性高、重复性好，操作简便的IBV检测方法。体外核酸扩增技术是一种通过使各种酶和温度等外界条件改变的情况下可使目的碱基序列在体外高效大量扩增的技术。重组酶介导等温扩增(Recombinase-ai
4、dedamplification,RAA)技术是在既有体外核酸扩增原理的基础上进化而来的体外等温快速核酸扩增技术，该技术通过重组酶、DNA聚合酶和单链结合蛋白三者的功能替代了传统意义上PCR的变性、退火和延伸等热循环核酸扩增过程。而荧光型RAA是在基础型RAA的基础上加入荧光探针，荧光探针随着目的基因片段的产生而被切割释放出荧光信号。建立的荧光型RAA检测方法操作步骤简便，只需一台体积很小的荧光信号接收仪在3742C恒温条件下20分钟内即可对样品完成检测并对结果进行可视化地判读，这对于条件简陋的基层工作环境来说十分方便，无需像其它大型仪器占用空间。本标准对操作人员要求不高，具有快速、特异、灵敏
5、、简便等特点，非常适用于养殖场和基层单位的快速检测。及时准确的诊断是IB防控的关键。本标准的制定丰富了IBV的分子生物学检测方法，为广西各级兽医实验室开展IBV监测和快速诊断工作提供技术手段和技术支撑，有利于开展动物疫病防控工作。制定该标准将对广西养禽业高质量发展和乡村振兴也起到很大的推动作用。2、项目来源根据广西标准化协会关于下达2023年第十二批团体标准制修订项目计划的通知(桂标协(2023)53号)，广西标准化协会将团体标准鸡传染性支气管炎病毒荧光重组酶介导等温扩增检测方法(项目编号2023-1201)的制定下达给广西大学、广西璞缔恩威生物技术有限公司、广西祝氏农牧有限责任公司、广西参皇
6、养殖集团有限公司、广西鸿光农牧有限公司、南宁市良凤农牧有限责任公司、广西金陵农牧集团有限公司、广西富凤农牧集团有限公司、广西园丰牧业集团股份有限公司、广西贵港市港丰农牧有限公司，由磨美兰教授主持。3、项目目的迄今为止，广西乃至全国均未制定检测IBV的荧光重组酶介导等温扩增检测方法的团体标准、地方标准、行业标准或国家标准。该病在临床上危害严重，迫切需要制定相应的检测标准来对该病进行快速诊断，以便及时调整应对该病的策略。本标准根据我国动物疫病预防和控制的迫切需要，基于IBV的群特异性和序列相对保守的M基因，研发了鸡传染性支气管炎病毒荧光重组酶介导等温扩增检测方法，该方法具有检测快速、特异性强、敏感
7、性高、重复性好，操作简便等特点，已在实验室反复验证，与qPCR方法的检测结果一致，并且在临床实际应用中效果显著。本标准具有针对性、适用性、可操作性和先进性。二、工作概况本标准技术是磨美兰教授承担的广西重点研发计划项目动物冠状病毒病防控关键技术集成创新研究与应用（桂科AB21238003）的部分科技成果。课题组在IBV的诊断、检测和防控措施等方面开展了大量研究和临床推广应用。2021年8月开始建立鸡传染性支气管炎病毒荧光重组酶介导等温扩增检测方法，收集样品进行处理和核酸抽提，并对该检测技术的应用条件进行不断完善。同时，开展了相关资料的收集整理工作，确定标准编写目标和依据，同时起草制订广西地方标准
8、项目建议书，积极开展标准的申报。2023年3月接到广西标准化协会下达的团体标准项目计划的通知后，迅速成立标准编制课题组，确定标准起草编写方案及时间进度表，并积极组织实施。2023年8月已完成标准初稿编写，通过广泛征求国内有关高等院校、研究所、企业的十位著名禽病学专家、学者的意见后，对意见稿进行了认真修改，使技术规程内容和形式更为科学、规范，最后形成了本标准征求意见稿和编制说明。本标准编制课题组人员包括：磨美兰、张桃妮、唐金文、张愉、陈基明、韦天超、黄腾、黄鉴妮、陈秋英、何晓霞、梁星雪、黄湘华、胡艳、黄玉敏、李和鸣、杨福剑、唐雪梅、陈莹、张宗尧、黄建炸、甘业仙、蒋维维、林铁昌、黄超、覃俊江、卢静
9、、苏保华、黎卓炎。各成员均具备多年专业知识，并且有丰富的实验室检测、临床诊治工作经验和地方标准编写经验，能保障制定本标准起草任务。具体分工如下：磨美兰：组长。负责标准的提出、起草、审定。张桃妮：负责标准方法的建立、验证。唐金文：负责标准方法的建立、验证。张愉：负责标准方法的建立、验证。陈基明：负责标准的起草、审核。韦天超：负责标准的外联。黄腾：负责组织标准的校正、审核。黄鉴妮：负责组织标准的校正、审核。陈秋英：负责盲样检测。何晓霞：负责标准验证。梁星雪：负责标准验证。黄湘华：负责标准验证。胡艳：负责标准验证。黄玉敏：负责标准验证。李和鸣：负责标准验证。杨福剑：负责标准验证。唐雪梅：负责标准验证
10、。陈莹：负责标准验证。张宗尧：负责标准验证。黄建烽：负责标准验证。甘业仙：负责比对试验。蒋维维：负责盲样检测。林铁昌：负责比对试验。黄超：负责盲样检测。覃俊江：负责盲样检测。卢静：负责比对试验。苏保华：负责比对试验。黎卓炎：负责盲样检测。三、标准编制原则1、政策性原则：本标准编写过程遵循国家相关法律、法规和国家标准。2、先进性原则：以国内外相关文献资料为参考，力求反映最新的科技成果;以国内同类标准的编写方法为基础，对本标准进行规范、充实和创新，使之具有先进性。3、经济性原则：本标准编制过程，从获取信息、起草、实验室试验、临床验证到形成征求意见稿的每一个环节，在确保质量的前提下均力行节约，利用有
11、限的经费圆满完成各阶段编写任务。4、适用性原则：本标准借鉴国内外IBV诊断的成功经验，并经本项目组的实验室和临床验证，完全按照要求编写，内容全面，形式规范，可操作性和实用性强。5、协调统一性原则：本标准参照国内相关标准的编写形式和表达方法，力求与国内相关标准协调统一。本标准通过持续查新，确保内容不与己有的国家、农业行业和地方标准相重复或矛盾。6、规范化原则：本标准是严格按照GB1.12020的要求来编写的。四、标准主要内容及依据本标准是动物疫病防控推荐性团体标准，编写重点是疫病的诊断。标准的主要依据是借鉴国内先进标准和技术内容，参考国内外相关文献资料，结合我国国情以及广西禽传染性支气管炎防控实
12、际，进行实践研究，并通过实验室试验和临床验证后提出。标准编写主要内容包括缩略词、试剂与材料、仪器设备、样品的采集和处理、操作步骤和结果判定等技术要求，适合于IBV的检测。标准的建立主要涉及以下试验：鸡传染性支气管炎病毒荧光重组酶介导等温扩增检测方法的建立1、材料和方法1.1 主要试剂RAA核酸扩增试剂盒（基础型）和RAA核酸扩增试剂盒（荧光型）购自杭州众测生物科技有限公司，DNA/RNA抽提试剂盒以及HiFiScriptcDNASyntheSiS试剂盒购自康为世纪科技有限公司，DNAMarkerDL500和PMD-18T载体购自南宁科迪生物（TAKARA）公司，琼脂糖购自楚杰科技有限公司。1.
13、2 实验材料病毒DNA/RNA的抽提根据DNA/RNA试剂盒提取要求,抽提本实验室保存的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、禽流感病毒（ArV）、禽偏肺病毒（aMPV）、新城疫病毒（NDV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）.马立克氏病毒（MDV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）以及采集的疑似IBV感染的144份病料的DNA/RNA,将RNA反转录得到cDNA,置于-20保存。1.3 标准质粒的构建以及引物和探针的设计将NCBI收录的代表性的IBVM基因序列进行比对分析后，将M基因片段与表达载体PMDTMI8-T进行16低温连接，转化至DH-5感受态细胞，冰浴30min,42C热激90s迅速放回冰上
14、静置3min。加800L不含抗生素的LB培养基，37,200rpm复苏3h,之后涂布至含氨半霉素抗性的LB平板，37培养12h-16h后挑取单菌落接种至含氨茉霉素抗性的液体LB培养基中培养3h后，进行菌液PCR鉴定，阳性结果送往生物公司进行测序。之后将测序符合预期的菌液以1:100的比例接种于新鲜的含100gmL氨茉霉素的LB液体培养基中，37C培养12-16h,之后抽提标准质粒保存于-20备用。按照RAA的引物和探针设计原则，三对引物和一对探针均设计在M基因的保守区域（表1）。表1荧光RAA引物和探针序列引物/探针序列(5,-3z)目的基因产物（bp）f1:Gttcaatactcctaact
15、aatggtcaacaatPrimer1R2：Cttagcaagccactgaccttcacaataaag37/-49119Primer2f2:Ggttcaatactcctaactaatggtcaac77AO21z)Qr2:AcacttagcaagccactgaccttcacaataJo-yof3:GccgtaggttcaatactcctaactaatggPrimer3370-501132r3:TtcacacttagcaagccactgaccttcacaIRV-PTAATGGTCAACAATGTAATTTTGCZibFAMdT/THFiBHQ1dT/AGAGAGTGTGCCAA-C3Space
16、r1.4 引物的筛选将设计的三对引物按照基础型RAA反应试剂盒说明书配置反应体系，并置于39恒温容器中反应30分钟，反应结束后，使用等体积的酚/氯仿进行提纯，然后在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳。1.5 荧光型RAA反应体系的建立使用IBV重组标准质粒作为模板按照RAA荧光型反应试剂盒说明书推荐的50L体系配制荧光RAA反应体系。先配置含有水、ABuffer上游引物、下游引物、探针的Mix,混合均匀后加入装有反应干粉的单元管中。之后向检测单元管加入CDNA样本，再向检测单元管盖上加入2.5L的BBUffelr,盖上管盖，上下颠倒充分混匀5-6次，低速离心IoSec。最后将检测单元管放入荧光检测
17、仪中，选择“FAM”荧光通道进行荧光RAA反应，39恒温检测20分钟。1.6 荧光型RAA反应条件的优化其他反应条件均按照荧光型RAA试剂盒的说明书进行操作，除进行引物浓度和探针浓度摸索外。将反应中引物浓度分别设置为2.5M5.0pM、7.5gM、10.0M和12.5M;荧光探针浓度分别设置为3.0pM、6.0pM、10.0pM、13.0M和16.0M0通过试验结果确定最佳的引物浓度和探针浓度。1.7 荧光型RAA反应的特异性试验使用优化好的反应条件，同时检测常见的禽类病毒：IBV、AIV.aMPV、NDVILTV.MDV、IBDV,验证方法的特异性。1.8 荧光型RAA反应的灵敏性试验将重组
18、标准质粒进行梯度10倍倍比稀释，选择IO4copiesLIO3copiesLIO2COPieSL10%opiesL和10。CoPieSL的阳性质粒作为模板进行荧光型RAA反应，验证该方法的灵敏性。1.9 荧光型RAA反应的重复性试验在同一时间段和不同时间段使用标准质粒配置荧光型RAA反应体系进行反应，重复3次。根据试验结果验证荧光型RAA反应的重复性。1.10 临床应用使用建立的荧光型RAA方法检测疑似IBV感染鸡只的肛拭子、咽拭子、肾脏、气管共144份样品，同时使用荧光定量PCR进行平行检测，比较两种方法的符合率。1.11 实验室间的方法比较根据方法标准验证要求，选择4家实验室进行实验室间方
19、法确认，确认方法的准确性。1 .确定4家实验室参加。分别是广西大学、广西璞缔恩蕨生物技术有限公司、广西祝氏农牧有限责任公司、广西参皇养殖集团有限公司。2 .实验室间方法确认的待检测样品共8份（每家实验室的待检样品相同，且每个样品重复检测三次），待检样品编号为1至8,阴性对照为编号9,阳性对照为编号10。2、结果2.1 引物的筛选根据琼脂糖凝胶电泳结果，选择条带单一，无引物二聚体，特异性好，扩增目的片段较短的引物1作为最佳引物（见图1）OM:DNA分子量标准;1:Primer1；2:Primer2；3:Primer3；4:阴性对照.图1荧光RAA方法引物筛选图2.2 荧光型RAA反应体系的建立以
20、阳性质粒作为模板，在520分钟内实时检测阴阳性样品扩增情况。结果发现5分钟内可完成荧光信号的采集，5-20分钟可完成样品的检测；阴性样品无荧光信号且无扩增曲线，阳性样品存在较强的荧光信号且出现明显的扩增曲线（见图2）。Tl:阴性对照;T2:阳性对照.荧光RAA在5分钟、10分钟、15分钟和20分钟的荧光曲线图如图a、b、C和d所示.图25-20min内荧光RAA扩增曲线图2.3 荧光型RAA反应条件的优化其他反应条件均按照荧光型RAA试剂盒的说明书进行操作，除进行引物浓度和探针浓度摸索外。经摸索最佳的引物浓度后发现，扩增效率随着引物浓度的增加而提高，考虑到成本，选择最合适的引物浓度10.0M（
21、见图3）。摸索最佳的荧光探针浓度，结果发现，RAA反应的荧光峰值随着探针浓度的增加而提高。综合考虑，选择最经济合理的探针浓度13.0M（见图4）。O5IO1520Time(mins)Tl:12.5M;T2:10.0M;T3:7.5M;T4:5.0M;T5:2.5M;T6:阴性对照.图3荧光RAA方法引物浓度摸索图Tl:16.0pM;T2:13.0MjT3:10.0M;T4:6.0M;T5:3.0M;T6:阴性对照.图4荧光RAA方法探针浓度摸索图2.4 荧光型RAA反应的特异性试验使用建立好的荧光型RAA方法检测常见的禽类病毒后发现，该方法仅针对IBV,与其他常见禽类病原无交叉反应（见图5）。
22、160I4OI2OOO2 IOOOOg 80J 600040002000IO1520Time (mins)TlT2TJT4TSTGTJT8Tl:IBV;T2:AIV;T3:aMPV;T4:NDV;T5:ILTV;T6:MDV;T7:IBDV;T8:阴性对照.图5荧光RAA方法特异性试验图2.5 荧光型RAA反应的灵敏性试验将IO4copiesLIO3copiesL102copiesL101copiesL和100copiesL的IBV阳性质粒样品作为模板进行荧光型RAA反应，测试该方法的灵敏性。结果发现，检测到的最低拷贝数为10%OPieSL（见图6）。Tl:IO4copiesL;T2:103c
23、opiesL;T3:IO2copiesL;T4:10lcopiesL;T5:100copiesL;T6:阴性对照.图6荧光RAA方法灵敏性试验图2.6 荧光型RAA反应的重复性试验由重复性试验结果可知，在同一时间和不同时间，实验结果均可以检测出相似的荧光信号，说明该方法重复性良好。2.7 临床样品检测应用建立的荧光型RAA方法检测144份临床样品，结果显示，132份为阳性，12份为阴性，和qPCR检测结果一致（表2）。表2临床样本检测组织总样本数qPCR检出样本数荧光RAA检出样本数相符率（%）气管161616100肾脏161616100肛拭子565252100咽拭子564848100总计14
24、41321321002.8 实验室间方法比较结果通过4家实验室的数据比对，4家实验室对8份待检样品的判定结果一致（表3-6）o说明鸡传染性支气管炎病毒荧光重组酶介导等温扩增方法可行、稳定，满足基层临床样品的快速检测。样品鸡传染性支气管炎病毒（是否检出）结果判定1（待检样品）是准确1（待检样品）是1（待检样品）是2（待检样品）是准确2（待检样品）是2（待检样品）是3（待检样品）是准确3（待检样品）是3（待检样品）是4（待检样品）是准确4（待检样品）是4（待检样品）是5（待检样品）否准确5（待检样品）否5（待检样品）否6（待检样品）否准确6（待检样品）否6（待检样品）否7（待检样品）否准确7（待检
25、样品）否7（待检样品）否8（待检样品）否准确8（待检样品）否8（待检样品）否9（空白对照）否准确10（阳性对照）是准确样品鸡传染性支气管炎病毒（是否检出）结果判定1（待检样品）是准确1（待检样品）是1（待检样品）是2（待检样品）是准确2（待检样品）是2（待检样品）是3（待检样品）是准确3（待检样品）是3（待检样品）是4（待检样品）是准确4（待检样品）是4（待检样品）是5（待检样品）否准确5（待检样品）否5（待检样品）否6（待检样品）否准确6（待检样品）否6（待检样品）否7（待检样品）否准确7（待检样品）否7（待检样品）否8（待检样品）否准确8（待检样品）否8（待检样品）否9（空白对照）否准确1
26、0（阳性对照）是准确样品鸡传染性支气管炎病毒（是否检出）结果判定1（待检样品）是准确1（待检样品）是1（待检样品）是2（待检样品）是准确2（待检样品）是2（待检样品）是3（待检样品）是准确3（待检样品）是3（待检样品）是4（待检样品）是准确4（待检样品）是4（待检样品）是5（待检样品）否准确5（待检样品）否5（待检样品）否6（待检样品）否准确6（待检样品）否6（待检样品）否7（待检样品）否准确7（待检样品）否7（待检样品）否8（待检样品）否准确8（待检样品）否8（待检样品）否9（空白对照）否准确10（阳性对照）是准确样品鸡传染性支气管炎病毒（是否检出）结果判定1（待检样品）是准确1（待检样品）
27、是1（待检样品）是2（待检样品）是准确2（待检样品）是2（待检样品）是3（待检样品）是准确3（待检样品）是3（待检样品）是4（待检样品）是准确4（待检样品）是4（待检样品）是5（待检样品）否准确5（待检样品）否5（待检样品）否6（待检样品）否准确6（待检样品）否6（待检样品）否7（待检样品）否准确7（待检样品）否7（待检样品）否8（待检样品）否准确8（待检样品）否8（待检样品）否9（空白对照）否准确10（阳性对照）是准确五、与现行法律、法规和有关标准的关系经查阅，未有与“鸡传染性支气管炎病毒荧光重组酶介导等温扩增方法”有关的标准。目前与传染性支气管炎病毒相关国家标准有1项,是GB/T23197
28、-2022鸡传染性支气管炎诊断技术；相关地方标准有8项，包括广西1项：DB45/T58-2002多重聚合酶链反应(MUlti-PCR)检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒和鸡毒支原体的技术操作规程，河北2项：DB13/T2614-2017鸡传染性支气管炎防控技术规范、DB62/T4143-2020鸡传染性支气管炎防治技术规范，吉林1项：DB22/T2922-2018鸡传染性支气管炎病毒检测荧光RT-PCR法，四川1项：DB51/T1312-2019鸡传染性支气管炎防治技术规范，甘肃1项：DB62/T4143-2020鸡传染性支气管炎防治技术规范，辽宁2项：DB21/T1888
29、-2011鸡传染性支气管炎诊断技术规范、DB21/T2592.2-2016鸡传染性疾病检测方法第2部分：鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR诊断技术；相关行业标准1项：SN/T1221-2016鸡传染性支气管炎检疫技术规范。但以上与传染性支气管炎病毒有关的所有标准均未涉及荧光重组酶介导等温扩增检测方法，且检测速度也不符合现阶段对于疾病快速诊断的要求。本团体标准的内容与现行的法律、法规及强制性标准无冲突，标准的编写符合GB/T1.1-2020的要求。六、重大分歧意见的处理经过和依据在制定本标准的过程中我们广泛征求了意见，对所征求意见都进行了充分讨论并进行进一步完善和修改。专家对标准主要内容无重大
30、分歧意见。七、作为强制性团体标准或推荐性团体标准的建议本标准结合广西鸡场临床实践的验证，可作为推荐性团体标准，用于基层鸡场IBV的快速检测和诊断。八、其他应予说明的事项本标准内容由广西大学动物科学技术学院“鸡传染性支气管炎病毒荧光重组酶介导等温扩增检测方法”编写小组起草，无抄袭盗用他人成果等违规行为。科学是迅速发展的，本标准也必将随着科技进步和生产水平的提高不断修改补充。由于时间仓促，水平有限，不妥及不足之处在所难免，恳请各位专家、学者提出宝贵的修改意见。九、自我承诺本标准内容与各项指标不低于国家强制性标准、推荐性国家标准和行业标准。鸡传染性支气管炎病毒荧光重组酶介导等温扩增检测方法编制小组2023年11月24日
