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1、2023漆黄素治疗骨质疏松症作用机制的研究进展骨质疏松症(OSteOPOrOSiS,OP)是一种全身性的骨骼疾病,其病理特征是骨密度降低、骨小梁微结构受损和骨质脆性增高，早期多无症状，后期临床表现为疼痛、脊柱变形和脆性骨折发生等，多发于绝经后女性和老年人群1。OP分为原发性和继发性两大类，临床上以原发性OP中的绝经后OP和老年性OP最为常见，一项纳入20416名受试者的横断面研究表明40岁或以上人群骨质疏松症的患病率在男性中为5.0%(95%C7:4.2%5.8%),在女性中为20.6%(95%67:19.3%22.0%)2随着我国社会老龄化的加剧，该病引发的一系列公共健康问题逐渐受到国家的重
2、视。由于中药多方向、多途径、多靶点的整体论治特点，在治疗骨质疏松症等衰老相关全身性疾病中取得了丰厚的成果。黄柏是漆树科植物黄道棉CotinuscoggyriaScop.var.cinereaEngl或毛黄棉CotinuscoggyriaScop.var.pubescensEngl的木材。本草拾遗中有载：黄植性寒、味苦，除烦热、解酒疽、目黄、水煮服之，中华本草中说明黄柏归肝肾经，功用活血散瘀，主治跌打损伤、骨折、虚肿等。漆黄素(FiSetin)是中药黄棉的有效成分,在防治骨质疏松症方面有着积极的作用3。OP的发生与衰老细胞及其表型的积累、氧化应激、炎症引发的骨代谢紊乱等多种因素密切相关，针对多方
3、面的致病因素，漆黄素可以通过多种途径达到延缓骨质疏松症进展的目的。因此，本文对黄棉有效成分漆黄素治疗OP的作用机制进行综述，为深入研究漆黄素治疗OP的基础研究以及新型药物开发提供研究依据。1漆黄素的结构、性质和药理作用漆黄素化学名称为2-（3,4-二羟基苯基）-3,7-二羟基-4h-苯并吠喃-4-酮,又称为3,3:4,7-四羟基黄酮,属于黄酮醇类化合物，其化学结构见图1,外观呈淡黄色粉末，易溶于乙醇、丙酮和醋酸，几乎不溶于水。不同黄酮醇类化合物之间药理作用的异同主要取决于其B环上取代基的极性、位置和数量4,漆黄素B环上取代基由两个相邻的羟基构成了反应性儿茶酚部分，研究证明这种结构可以与DPPH
4、快速反应形成二聚体从而提供了更优秀的抗氧化活性。除此之外，漆黄素的B环结构更有利于通过与多肽链上的氨基酸残基形成氢键和偶联效应从而实现对蛋白质的调控，研究证明漆黄素可以通过抑制靶基因启动子中KB结合、抑制ERKI/2磷酸化、抑制JAK/STAT-1激活或直接中断LPS与toll样受体的结合等方式达到抗炎、抗肿瘤、抗衰老等目的5,在0P、骨关节炎、骨肉瘤等骨科疾病中起到重要作用6。2漆黄素通过靶向消除衰老细胞治疗OP衰老细胞（SeneSCentcells,SnCS）及其分泌表型（SASP）是影响衰老及其相关疾病的主要因素7。Farr等网观察到老年小鼠（24个月）较年轻小鼠（6个月）骨/骨髓中的衰
5、老骨髓细胞、衰老成骨细胞祖细胞、衰老成骨细胞和衰老骨细胞显著增高，也观察到老年小鼠骨细胞中多个SASP标志物表达显著增多。基于以上结果，Farr等9通过构建OP模型小鼠,靶向诱导半胱天冬酶8表达促进SnCs凋亡后,观察到骨小梁厚度与骨皮质厚度显著增加，证明了SnCS与OP的因果关系。Chandra等10也证明放疗后OP小鼠的骨组织中衰老成骨细胞和衰老骨细胞增加，通过比较放疗后骨组织与衰老骨细胞中p21andp16Ink4a的变化趋势，明确了SnCS与OP的密切联系，靶向清除这些SnCs后,可以观察到小鼠每骨表面骨形成率(BFR/BS)增加4.5倍，进一步证明了SnCs积累是OP的发病机制之一。
6、既往研究证明，漆黄素可以通过抑制BCL-2/BCL-XL家族蛋白表达、激活MDM2p53通路等多种途径靶向清除SnCs11z相对于达沙替尼等人工合成靶向清除SnCs药物具有更好的安全性和剂量耐受。Hambright等12利用Zmpste24缺陷小鼠构建OP模型,每周4次喂食漆黄素，连续给药一个月后应用CT测量发现CT值、骨密度(BMD)和骨表面积与骨体积比值(BS/BV)显著增高，除此之外，他们应用达沙替尼和榔皮素(DQ)联合用药治疗ZmPSte24缺陷小鼠后，骨小梁数(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨体积分数(BV/TV)都无改善，通过比较漆黄素与DQ所调节信号通路异同，发现SIRT
7、1和AKT可能是漆黄素治疗OP的关键靶点。总之，漆黄素可以通过靶向清除OP骨组织中由衰老成骨细胞、衰老骨细胞等组成的SnCs群改善骨密度与骨微结构，达到延缓OP进展的目的，其关键靶点可能是SIRT1和AKTo3漆黄素通过促进成骨细胞分化治疗OP成骨细胞是骨骼形成、发育的主要功能细胞，通过分泌I型胶原蛋白、骨钙素、骨连蛋白、骨桥蛋白等类骨质，羟磷灰石和胶体磷酸钙等无机质沉积并结合于类骨质最终形成骨骼13o骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCS)的成骨分化是成骨细胞的主要来源,BMSCs的增殖与成骨分化在骨形成过程中发挥关键作用，是目前治疗OP的关键靶点之一
8、14。多项研究证明，漆黄素改善成骨细胞分泌类骨质功能的同时可以促进类骨质的矿化，还可以促进BMSCs的成骨分化从而促进骨骼生长发育。Leotoing等15通过体外实验发现漆黄素可以通过上调Run2mRNA的转录活性促进Runx2与骨钙素基因启动子的相互作用，从而促进骨钙素和I型胶原蛋白的表达，促进了成骨细胞的矿化过程，之后该团队应用漆黄素干预OP小鼠，发现缺乏的骨钙素和I型胶原蛋白被部分改善证明漆黄素可以通过调节Runx2转录活性增加成骨细胞分泌类骨质能力。Molagoda等16也证明了以上研究成果，除此之外，他们还发现漆黄素可以抑制活化T细胞细胞质I(NFATCl),酒石酸盐抗性酸性磷酸酶-
9、6(ACP6)和组织蛋白酶K(CTSK)等抗成骨细胞基因的转录活性，证明了漆黄素可以促进糖原合酶激酶-3(GSK-3)Ser9位点的磷酸化，导致GSK-3失活进而促进B-Catenin的稳定与核易位,下调OP小鼠的BMSCs成骨分化被抑制程度，促进成骨。Liang等17通过网络药理学结合体外实验的方式也证明了漆黄素可以通过调节Wnt-catenin通路促进BMSCs的成骨分化，同时，他们还验证了漆黄素对BMSCs的细胞毒性作用，发现只有在高浓度(20molL).长时间(72h)干预下才会产生细胞毒性。漆黄素除了可以调节B-Catenin信号改善OP成骨,Xu等口8通过连通图(CMaP)方法和细
10、胞实验证明漆黄素也可通过激活PI3K-AKT通路促进前成骨细胞增殖、分化为成骨细胞。总而言之，漆黄素可以通过调节多种信号通路促进BMSCS定向成骨细胞分化,也可以提高成骨细胞分泌骨钙素、I型胶原蛋白等类骨质的能力，促进类骨质与钙磷酸盐等无机质的结合，全过程、多途径地促进骨骼形成、发育过程，且具有良好的安全性。4漆黄素通过保护成骨细胞治疗OP随着OP中有关程序性细胞死亡(PCD)研究的深入，靶向降低成骨细胞活性失衡逐渐成为治疗OP的新方向。研究表明，细胞凋亡、铁死亡和焦亡可能是成骨细胞活性失衡的主要PCD途径。细胞凋亡是绝大部分成骨细胞的死亡途径ang等19认为年龄相关性的骨质流失伴随着成骨细胞
11、凋亡的增加，这些与ROS水平增高密切相关，雌激素、维生素E等物质对OP的改善是通过抗氧化作用实现的。Lu等20通过建立糖皮质激素诱发的骨质疏松(GloP)模型,证明糖皮质激素通过抑制systemXC-和GPX4表达导致GSH被耗尽，ROS过度增加，引发成骨细胞铁死亡导致骨质流失。Tao等21通过总结发现，在年龄相关性OP或炎症相关性OP中，由ROS触发的NLRP3炎症小体可以激活Caspase-1切割细胞焦亡关键因子GSDMD(GaSderminD),释放出活性片段GSDMD-NT锚定于成骨细胞膜上促进质膜孔形成,最终导致成骨细胞焦亡。总之，不同PCD途径导致的成骨细胞活性失衡都与ROS密切相
12、关。目前虽然没有直接证据证明漆黄素通过保护成骨细胞摆脱PCD而治疗OP,但是既往多项研究已经证明了漆黄素优秀的抗氧化能力，因此，通过消耗过量ROS抑制成骨细胞不同PCD途径可能是漆黄素治疗OP的途径之一。5漆黄素通过抑制碱骨细胞分化治疗OP破骨细胞与成骨细胞功能相反，是骨骼重塑的主要功能细胞，通过营造酸性环境、分泌胶原酶、基质金属蛋白酶等水解酶先后溶解和消化骨基质中的无机成分和有机成分，破骨细胞过度活动时，会引起骨质流失最终导致OP22.骨化中心的胚胎红髓系祖细胞(erythrocytemyeloidprogenitorcells,EMPS)的破骨细胞分化是破骨细胞的主要来源，EMPs首先分化
13、为巨噬细胞，之后互相融合成破骨细胞23。破骨细胞分化受到多种信号通路的调控，尤其是核因子KB配体(RANKL)相关通路可以强烈刺激破骨细胞分化，以下对漆黄素如何调控RANKL相关通路进行详细论述，互作机制示意图见图2o图2漆黄素调控RANK/RANKL信号通路抑制破骨细胞分化互作机制示意图pathwaytoinhibitosteoclastdifferentiationinteraction5.1 漆黄素通过减少MKP-1泛素化抑制RANKLP38MAKP信号通路既往研究证明，漆黄素可以调节多个RANKL相关通路抑制破骨细胞分化从而减少骨质流失治疗OPoChoi等24证明漆黄素通过抑制由RAN
14、KL诱导的P38MAPK信号通路的激活，进而抑制了即刻早期应答基因C-FoS基因和活化T细胞因子CI(NFATCl)的激活，它们分别是破骨细胞分化过程早期阶段和中晚期阶段的转录因子，进而抑制包括组织蛋白酶K等多种水解酶在破骨细胞中的表达。同时,Choi等24发现漆黄素还可能具有通过抑制树突状细胞-特异性跨膜蛋白(DC-STAMP)表达从而抑制破骨细胞分化的能力，除此之外，他们还证明漆黄素通过以上途径抑制破骨细胞分化都具有剂量依赖性特点。Leotoing等25通过体外试验得出了与Choi等24相似的结果，但是他们明确了漆黄素是通过抑制MAPK磷酸酶-I(MKP-I)与多泛素链的偶联维持了MKP-
15、1的稳定，从而相对上调了MKP-1对P38MAKP降解能力，进而抑制了破骨细胞分化。同时，Motoing等25也证明了漆黄素对RANKL诱导的JNK信号通路和NF-B信号通路也有抑制作用，除此之外，他们通过动物实验证明了漆黄素在由雌激素缺乏引起的OP小鼠模型和由炎症引起的OP小鼠模型中都展现出抑制骨质流失能力。综上漆黄素通过减少MKP-1泛素化抑制RANKLP38MAKP信号通路进而抑制相关转录因子，最终抑制破骨细胞分化进程，降低胶原酶、明胶酶等多种水解酶的分泌，延缓骨质流失，达到治疗OP的目的。漆黄素通过减少氧化应激抑制RANKL下游信号通路1.ee等26发现RANKL激活破骨细胞分化过程初
16、始阶段会通过肿瘤坏死因子受体6(TRAF6)RAC1NADPH氧化酶I(NOXI)信号级联反应产生ROS,这些ROS充当信号因子激活了下游JNK.ERK和MAPK信号通路，进而导致破骨细胞分化，虽然这些ROS可以被成骨细胞产生的抗氧化物质所消除，但当其他途径产生的ROS超过抗氧化能力导致氧化应激时，就会加速破骨细胞分化27,从而破坏破骨细胞骨吸收与成骨细胞骨形成之间的平衡状态，导致OP发生，因此抗氧化剂补充疗法逐渐成为治疗OP的研究热点，多项研究已经证明抗氧化剂有助于降低破骨细胞活性28。漆黄素具有优秀的抗氧化能力，它一方面可以直接抑制ROS的生成降低细胞氧化应激水平，也可以通过增加谷胱甘肽(
17、GSH)水平消耗过多的ROS29另一方面，漆黄素可以促进线粒体自噬去除功能缺失的线粒体，减少ROS的生成30。Feng等31应用漆黄素治疗由卵巢切除术(OVX)诱导的OP小鼠，观察到谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SoD)水平都显著升高，小鼠骨骼中骨矿物质含量(BMC)、BMDx最大负荷和骨骼刚度等生化参数水平都得到明显改善，证实了漆黄素可以通过减少氧化应激治疗OPo5.2 漆黄素通过调节炎性因子下调RANK/RANKL表达研究发现OP患者的血清高敏C反应蛋白(hsCRP)等炎性相关指标相对较高32,骨关节炎(OA)、强直性脊柱炎(AS)和类风湿关节炎(RA)等骨组织
18、炎性疾病患者往往伴随严重程度不同的骨质流失33。除此之外，目前认为绝经后骨质疏松(PMOP)是由于雌激素下降引发的炎性因子增加诱导破骨细胞加速分化所导致34,因此，抑制炎性因子在延缓OP发生发展中起到重要作用。漆黄素可以从多个方面减少炎性因子对破骨细胞分化的促进作用。一方面漆黄素可以通过与蛋白激酶C(PKC)直接结合抑制TNF-砌能35,既往研究表明TNF-C(可以促进巨噬细胞增加RANK表达和诱导基质细胞增加RANKL表达36,漆黄素通过抑制TNF-O以上作用进而抑制破骨细胞分化。另一方面，漆黄素可以通过多个途径抑制NLRP3炎症小体的激活，Huang等37证明漆黄素可以通过抑制FGFRl/
19、TLR4信号通路参与抑制NLRP3炎症小体的激活，Pu等38证明漆黄素可以通过上调GSK30/AMPK信号传导抑制NLRP3、NLRP7炎症小体的激活，NLRP3炎症小体是一种蛋白质复合体，是炎症反应的启动开关之一，可以促进半胱天冬酶-I(CaSPaSe-I)对IL-邛的力口工，IL-邛被加工后产生活性，结合其在T淋巴细胞，B淋巴细胞和巨噬细胞上的受体，促进RANKL的产生,并与破骨细胞前体细胞上的RANK结合，从而促进破骨细胞的分化和活化39。总之，漆黄素通过多途径抑制TNF-祝能和NLPR3炎症小体的激活，进而抑制RANK/RANKL的产生和表达，阻断破骨细胞分化起始信号，延缓OP进展。6
20、总结与展望OP的主要症状是疼痛、脊柱变形和脆性骨折,属于中医骨痹骨痿范畴，多数学者认为OP为本虚标实之证，本虚在肾，标实在瘀40,正如王清任在医林改错中强调的痹症有瘀血说，瘀血是OP的病理基础，古今医家都将活血化瘀作为OP的根本治则之一41。黄棉的主要活性成分漆黄素有活血化瘀功效，与中医辨证论治思路十分契合，除此之外，由于OP发病机制复杂，漆黄素多靶点联合起效的特点在OP治疗中拥有巨大的潜力，通过保护、促进成骨细胞增殖分化，抑制破骨细胞分化，清除OP相关SnCs群，恢复并维持骨吸收-骨新生平衡，延缓骨质流失，改善骨微结构和骨密度，对多种类型OP起到治疗效果。漆黄素早期多被用作癌症治疗的补充疗法
21、，随着SnCs及SASP致病机制的提出，同时由于漆黄素在癌症治疗中表现出优秀的靶向诱导细胞凋亡能力，因此，漆黄素被纳入sen。IytiCS药物范畴而被广泛应用于多种衰老相关疾病，尽管漆黄素治疗OP的研究不断深入，但是在未来还应注意完善以下方面：目前漆黄素治疗OP研究仅局限于细胞实验和动物实验中，今后需要尝试在临床试验中验证其治疗效果。研究表明漆黄素清除SnCsx抑制破骨细胞分化都存在剂量依赖性特点，但是鲜有量效关系相关研究，同时，也有研究显示高剂量漆黄素可能会产生细胞毒性，因此明确OP不同阶段下的最优剂量，既有助于增强漆黄素治疗效果，也对临床安全提供保证。由于漆黄素难溶于水，传统剂型存在生物利用低的特点，但是漆黄素的剂型相关研究却鲜有报道，改进漆黄素提取工艺以及开发新的药物剂型提高溶解性和生物利用程度，可使药物疗效最大化。另外，多种如铜死亡、双硫死亡等新型细胞程序性死亡途径被发现，意味着可能会有更多的信号通路被证明与成骨细胞死亡有关，同时，如何利用OP相关SnCs于不同细胞死亡途径的死亡风险从而靶向清除SnCs也是值得思考并研究的问题，这些更加证明了漆黄素多靶点、全方位治疗OP的科学性。（参考文献略）
