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1、ICS11.220CCSB41NY中华人民共和国农业行业标准XXTXXXXX-XXXX代替XX/T犬冷冻精液生产技术规程Technicalcodeofcaninefrozensemenproduction（点击此处添加与国际标准一致性程度的标识）（征求意见稿）XXXX -XX-XX 发布XXXX-XX-XX实施中华人民共和国农业农村部发布本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国伴侣动物（宠物）标准化技术委员会（SAC
2、/TC541）归口。本文件起草单位：公安部南昌警犬基地、中国畜牧兽医学会犬学分会、农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心（南京）、公安部昆明警犬基地、北京小动物诊疗行业协会。本文件主要起草人：余盼、叶俊华、吴衍、熊前、李川武、李莲、王振云、李杰、王春亮、肖远鹏项茹雪、杨雪芹、潘苹芋。犬冷冻精液生产技术规程1范围本文件规定了犬的冷冻精液生产过程中的采精、检查、稀释、冷冻、包装、贮存和运输。本文件适用于犬的冷冻精液生产。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版木（包括所有的修改
3、单）适用于本文件。GA/T2000.233-2018警用犬种代码GB/T5458-2012液氮生物容器3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2 1采精semencollection用徒手或人工模拟工具，获取公犬精液的方法。3 j）精子密度spermconcentration每单位体积精液中的精子数目，单位亿个L来源：GB/T25172-2020,3.4精子活力SemenmotiIity37下呈前向运动精子数占总精子数的百分率。来源：GB/T25172-2020,3.34 4冷冻精液frozensemen经特殊方法处理的精液超低温冷冻后再液氮中（T96）长期保存。来源：GB4143-2008,
4、3.55 5细管straw一端封闭另一端开口，用于分装精液的聚乙烯复合材料的塑料。管体要求厚薄均匀一致，在常温至超低温（T96C）环境下不变形、不破裂。来源：GB/T30396-2013,3.54采精A1种公犬要求健康，具有种用价值。6 9采精室要求采精场所应保持安静，地面防滑，清洁卫生。1采精前准备4.3.1采精员应着洁净工作衣、帽，戴一次性塑料手套。4.3.2玻璃器皿和采精器具清洁消毒应符合附录A的规定。集精杯、载玻片、盖玻片、精液处理器皿和稀释液应预热至37C。4.3.3显微镜载物台恒温板应预热至37精子密度仪使用前应预热。44采精步骤4.4.1清洁体表，擦干水渍。阴毛过长时应适度修剪。
5、包皮确需冲洗的，冲洗干净30min后才可进行采精操作。4. 4.2手握法采精时，应一只手戴无毒乳胶手套，按摩公犬包皮部，待阴茎开始勃起时，把包皮往上推至露出阴茎球，握住阴茎球后端，同时给阴茎适当的按压，当阴茎充分勃起后犬开始射精。待射出透明的第一部分水样液体后，另一只手持集精杯置于阴茎下方，收集第二部分乳白色精液。dK采精频率成年种公犬每周采精两次到三次。AA清洁采精结束后，及时清扫冲洗干净场地。5精液检查51精液处理室应设精液检查、稀释和分装区，温度宜控制在22C25C,不应太阳光直射。K9外观可采用目测法对精液外观进行检查。主要观察精液的色泽、气味及是否有脓性分泌物、毛发等异物。正常情况下
6、，精液为乳白色或者微黄，略有腥味。，Z采精量直接读取集精管上刻度（精度不小于0.1ml）oK4精子密度采用精子密度仪或可见光分光光度计法测定。应定期用血细胞计数板法校正。A精子活力取约5UL10IIL精液至于载玻片上，加盖盖玻片，在37恒温装置的相差显微镜下用200倍400倍评定活力。每样片观察3个视野。活力用百分率表示，例如80%或0.8。KA精液评价外观正常，密度大于等于IXIOB个mL,活力大于等于65%的精液可进行后续处理。6精液稀释、平衡和标识A1稀释量根据精液的密度、活力、采精量等确定精液稀释液量。稀释液配方见附录B。AJ一步稀释、平衡法等温稀释液缓慢加入精液，摇匀后，可选以下任何
7、一种进行平衡：方法一：先灌装后平衡。将稀释后的精液，在20C25C下进行封装，封装后的细管放入3C5 的低温柜中平衡1.5h4ho方法二：先平衡后灌装。将稀释后的精液放入含有3234C水的容器中，放入3C5的低温柜内降温平衡L5h4ho在低温柜中进行细管封装。空细管提前降温至3C5eCo6 1两步稀释、平衡法将精液放入一定容器的3234C水浴中，用等温的的第一液缓慢加入精液中，至稀释总量的一半，摇匀，并尽快放至35的低温柜中降温，第二液同时放至3C5C的低温柜中。水浴降温下平衡L5h2.5h,加入等温第二液至稀释总量。完成稀释后可继续平衡40min,并于低温柜中进行封装。A4标识6. 4.1细
8、管标识可采用喷墨打印机、激光打印机以及标签贴纸等方式进行标记。7. 4.2细管上所印字迹应清晰易认，信息齐全。标识内容应符合附录C的规定。7精液冷冻8. 1上架7.1.1 封装后的细管精液上架码放时应注意细管摆放的方向，把棉塞封口端靠近操作者，封装口端远离操作者，入冷冻仪时亦应如此放置。7.1.2 不同犬的细管精液，要分开码放，两只犬精液之间隔开一些距离，或者用标记物标记。73冷冻7.2.1程控冷冻法在电脑中设置好冷冻的最佳温度曲线，冷冻仪与低温柜应尽量靠近，开启液氮罐阀门把冷冻仪降温至4,将已排满待冻细管的架子迅速放入冷冻仪，盖严盖子，运行设定好的冷冻程序。7.2.2自制冷冻箱法7.2.2.
9、1用自制的冷冻箱冷冻细管时，冷冻箱的深度应在50cm以上。7.2.2.2冷冻的温度一般控制在-140左右，初冻温度调节至T2Oc左右，冷冻时温度回升的最高值不得高于-90C,整个冷冻过程控制在8min之内。细管熏蒸后，投入液氮。71冷冻精液质量检查预先把水浴箱水温加热至38-40,用镜子取一支细管冷冻精液迅速浸泡入38C40水中并晃动，待溶解后立即取出，用吸水纸或纱布擦干水珠，再用细管剪剪去封口端，将精液吹入一小试管内，取解冻精液进行活力检查，操作方法见5.5,检查合格的冷冻精液作为合格品妥善保存。8冷冻精液包装和贮存R1收集冷冻完成后，冷冻精液按犬名做好标识，细管的封口端在上，棉塞封口端在下
10、，迅速浸泡在液氮中。R7贮存贮存冻精的低温容器应符合GB/T5458-2012规定，冷冻精液应浸在液氮中，由专人负责并及时观察补充液氮量，如发现液氮罐外壳结白霜，立即将精液转移入其他液氮罐内保存。由一个容器转移至另一个容器时，间隔时间不得超过3s。9运输01在液氮生物容器皤体外明显位置标上“向上”“小心轻放”等储运图示标志。G5液氮生物容器应轻装轻卸，不得倾斜、横倒、碰撞和强烈振动，确保冷冻精液始终浸泡在液氮中。9a冻精运输过程中要有专人负责，移动液氮生物容器应提握液氮生物容器手柄，抬起罐体后移动。10记录做好冷冻精液生产相应记录，精液生产记录表见附录D。附录A（规范性）器具清洗和消毒A.1玻
11、璃器皿A.1.1首次使用玻璃器皿用自来水冲洗，去除灰尘。放入5%稀盐酸中浸泡12h,取出后立即用自来水冲洗；再用手工或者超声波洗涤器中洗涤15min30min,自来水冲洗干净后，用蒸储水冲洗，直至器皿光亮、无水滴附着为止。洗净的玻璃器皿用锡箔纸封口后送入消毒灭菌设备（如电热干燥箱、消毒柜、红外灭菌柜等）内，按操作说明书进行干燥、消毒、灭菌后待用。A.1.2使用过的玻璃器皿用自来水冲洗；遇有污物或者油垢不易清洗的器皿，放入重珞酸钾溶液中浸泡数小时，取出后立即用自来水冲洗，后续步骤同C.1.1。A.2采精器具玻璃集精杯清洗消毒同C.1。塑料集精漏斗、集精管和盖子使用后，用水冲去表面污垢，在加有洗涤
12、剂的温热水中用长毛刷刷洗，然后用水冲洗干净，再用蒸储水逐个冲洗。将洗净的采精装置堆放在架子上，上覆盖两层清洁纱布，晾干后用长柄镶子夹75%的酒精棉球由内向外旋转彻底消毒三角漏斗和采精管，待酒精挥发尽后方能使用。A. 3纱布洗干净经高压灭菌后待用。A.4其他器皿金属镜子、止血钳、药匙、胶塞和吸管胶头等用75%的酒精擦拭消毒，待酒精挥发尽后方能使用。细管、冷冻架使用前紫外灯消毒30mino附录B（资料性）冷冻精液稀骨液的配方与配制1.1 稀释液配制要求1.1.1 所有化学试剂为化学纯以上；使用来源于非疫区无疫病机场的新鲜鸡蛋；稀释液溶剂为双重蒸储水或超纯水。1.1.2 商品稀释剂按说明书使用。不得
13、使用过期的稀释剂。B. 2配方Tris3.025g柠檬酸L7g果糖1.25g谷胱甘肽01mmol加水至100mL青霉素10万IU链霉素10万IU甘油5mLC. 3配制方法准确称量化学试剂，加超纯水定容、溶解、灭菌，取一定量的溶液加入卵黄和抗生素搅拌均匀后待用，盛装稀释液的容器应做明显标记。使用前配置，配制后及时贴上标签，标明品名、配制日期、时间和经手人。剩余稀释液应密封后置于冰箱中冷藏，时间不超过24ho附录C（规范性）细管冷冻精液标记方法C.细管冷冻精液标记方法细管冷冻精液标记由十五位数三部分组成，排列顺序如下：a）第一部分：犬来源代码三位数。按GA/T2000.226-2018执行；b）第
14、二部分：冻精生产日期六位数。按年月日次序排列，年月日各占二位数字，年度的后两位数组成年的二位数，月、日不够二位的，月、日前分别加“0”补充为二位数；c）第三部分：犬芯片号的后五位数。示例：302230507805235棉塞封口端第一部分第二部分第三部分封口端第一部分中302,为国内民间的代号。b第二部分中230507为2023年5月7日的生产日期代号。第三部分中805235,为犬芯片号15100000805235的后5位数。图C.1细管冷冻精液标记条附录D（资料性）精液生产记录表D.1精液生产记录表见表D.1。表C.1精液生产记录表序号日期-芯号犬名品种采精员采精用精液颜色精子活力精子密度检杳员稀释比例-衡间-冻量冷冻后活力冷冻操作员备注参考文献1 GB/T25172-2020猪常温精液生产与保存技术规范2 GB4143-2022牛冷冻精液3 GB/T30396-2013牛冷冻精液包装、标签、贮存和运输S
