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1、保健食品功能检验与评价方法（2023年版）改善缺铁性贫血I .1试验项目II .1动物实验1.1.1.1 体重1.1.1.2 血红蛋白1.1.13 红细胞压积/红细胞内游离原吓咻1.1.14 体试食试验1.1.14.1 血红蛋白1.1.14.2 清铁蛋白1.1.14.3 细胞内游离原吓咻/血清运铁蛋白饱和度1.2 试验原则1.2.1 2.1动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。1.2.2 针对儿童的人体试食试验，只测血红蛋白和红细胞内游离原吓咻。1.2.3 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。1.3 结果判定1.3.1 动物实验：血红蛋白指标阳性，红细胞内游离原
2、叶咻/红细胞压积二项指标一项指标阳性，可判定该受试样品改善缺铁性贫血动物实验结果为阳性。1.3.2 人体试食试验.1针对改善儿童缺铁性贫血功能的，血红蛋白和红细胞内游离原吓咻二项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血作用。1.3.2.2针对改善成人缺铁性贫血功能的，血红蛋白指标阳性，血清铁蛋白、红细胞内游离原叶咻/血清运铁蛋白饱和度二项指标一项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血作用。改善缺铁性贫血检验方法1动物实验1.1 原理用低铁饲料喂饲动物可形成实验性缺铁性贫血模型，再给予受试样品，观察其对血液细胞学、血液生化学等指标的影响，可判定该受试样品对改善动物缺铁性贫血的作用。1.
3、2 实验动物健康初断乳大鼠，单一性别，每组大鼠8-12只。1.3 低铁饲料配方：成分添加量g玉米淀粉529.5蛋清蛋白东200.0蔗糖100.0玉米油(无添加剂)70.0纤维素50.0混合矿物盐(AIN-93G-MX)35.0混合维生素(AlN-93G-VX)10.0L-胱氨酸3.0氯化胆碱2.5*亦可使用EDTA处理的酪蛋白AIN-93G混合矿物盐配方矿物质添加量gormg/kgmixCalciumcarbonateanhydrous357.00Potassiumphosphatemonobasic196.00Potassiumcitrate,tripotassiummonohydratc7
4、0.78Sodiumchloride74.00Potassiumsulfate46.60Magnesiumoxide24.00Zinccarbonate1.65Sodiummeta-siIicater9H2O1.45Manganouscarbonate0.63Cupriccarbonate0.30Chromiumpotassiumsulfatcri2H2O0.275Boricacid(17.5%B).mg81.50Sodiumfluoride(45.24%F),mg63.50Nickelcarbonate(45%Ni),mg31.801.ithiumchloride(1638%Li),mg17
5、.40Sodiumselenateanhydrous(41.79%Se),mg10.25AIN-93G混合维生素配方维生素添加量g/kgmixNicotinicacid3.000Capantothenate1.600Pyridoxine-HCl0.700Thiamin-HCl0.600Riboflavin0.600Folicacid0.200Biotin0.020VitaminB-12(cyanocobalamin)(0.1%inmannitol)2.500VitaminE(all-rac-a-tocophcrylacctatc)2(500IUg)15.000VitaminA(all-tran
6、s-retinylpalmilate)2(500,000IUg)0.800VitaminD-3(cholecalciferol)(400,000IUg)0.250VitaminK-I(phylloquinone)0.075Powderedsucrose974.6551.4 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个低铁对照组，以人体推荐量的5倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组（硫酸亚铁或乳亚铁，ppmJc2mggBW,以Fe元素计）受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。1.5 实验步骤1.5.1 建立缺铁性贫血大鼠模型选用健康断乳大鼠在实验环境下适应35天后
7、饲予低铁饲料及去离子水（或双蒸水）采用不锈钢笼及食罐，同时，采用剪尾取血法放血，5天一次，每次0.30.5ml。实验过程中避免铁污染。自第3周开始每周选取部分大鼠采尾血测Hb,如多数动物Hb低于Ioog/L时，测定全部大鼠的体重及Hb01.5.2 恢复实验选取HbVlOOg/L的大鼠作为实验动物，根据贫血大鼠Hb水平和体重将其随机分为低铁对照组和三个实验组，各组均继续饲予低铁饲料，低铁对照组给予相应溶剂，实验组分别给予不同剂量的受试样品，受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天，测定体重及各项血液学指标。1.6 观察指标体重、血红蛋白、红细胞压积/红细胞内游离原口卜咻。1.6.1 血红蛋白
8、测定（IK化高铁法）消光系数法和标准曲线法任选其测定血红蛋白。在满足实验方案和仪器要求的前提下，也可采用血液分析仪测定。1.6.1.1 吸光系数法1.6.1.1.1 原理血红蛋白(haemoglobin,Hb)被铁新化钾氧化后生成高铁血红蛋白，再与就离子结合形成凯化高铁血红蛋白(红色)鼠化高铁血红蛋白(红色)极为稳定，在540nm波长下，摩尔吸光系数为44000,据此，用分光光度法测其光密度，运用吸光系数作血红蛋白的定量测定。1.6.1.1.2 仪器分光光度计。10微升微量吸管。1.6.1.1.3 试剂称取碳酸氢钠(NaHCo3,AR)140ng铁银化钾200mg、氟化钾50mg,用水溶解并稀
9、释到IOoOmL。贮存于棕色试剂瓶内，在暗处或冰箱(4C)保存，至少可稳定数月到1年。1.6.1.1.4 实验步骤1.6.1.1.4.1 取试剂2.5mL于5mL带盖试管中，加入10L血液，混匀后，放置15分钟。1.6.1.1.4.2 选用0.5厘米光径比色杯，于54Onm波长下，以试剂调零点，将所得样品管之光密度乘以736,即为血红蛋白浓度(gL),计算公式如下：C=DMWX25164458=D54oX736t440000.5HiCNCt=待测的血红蛋白(gL)浓度。D徐二制化高铁血红蛋白在540nm波长下测出的光密度。251=测定时血液的稀释倍数（血IOL加入试剂2.5mL中）44000=
10、制化高铁血红蛋白的摩尔吸光系数0.5=比色杯的光径64458=血红蛋白的分子量1.6.1.1.5 注意事项1.6.1.1.5.1 试剂不要放在聚乙烯瓶内，以免因鼠离子与其反应而使试剂作用降低。1.6.1.1.5.2 仪器因摩尔吸光系数法完全依靠仪器的吸光度来计算，故此法要求所用的仪器性能要符合要求（如仪器的波长准确与否，以及灵敏度及线性等）否则将直接影响测定的结果。1.6.1.1.53仪器在使用前最好应以WHO规定的氟化高铁血红蛋白参考液校正后再使用。参考液最好选用ICSH（国际血液学标准化委员会）确定的由RIV（荷兰国立公共卫生研究院）制作的制化高铁血红蛋白参考液或上海医学化验所制备的氧化高
11、铁血红蛋白标准液。1.6.1.2 标准曲线法1.6.1.2.1 原理血红蛋白（hemoglobin,Hb）在铁制化钾和凯化钾的作用下生成极为稳定的辄化高铁血红蛋白（红色）其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比。用分光光度计在540nm波长下，测定血红蛋白标准品和参考标准物质的吸光度，制成标准曲线，测得待测样品的吸光度后查标准曲线即可得Hb的浓度。1.6.1.2.2 仪器10L血色素吸管（或定量毛细管）5mL或IOmL带盖试管分光光度计1.6.1.2.3 试剂称取碳酸氢钠（NaHCO3,AR）140mg铁辄化钾200mg、和七钾50mg,用蒸储水溶解并稀释到IooOmL,贮存于棕色试剂瓶内，保存于4冰
12、箱可稳定至1年。1.6.1.2.4 实验步骤吸取2.5mL试剂于5mL带盖试管中，用10L血色素吸管（或定量毛细管）取大鼠尾血或静脉血10L放置于已放入试剂的试管中；混匀放置15min0选用0.5Cm光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调节仪器零点，测定各样品管的吸光度，同时测定血红蛋白标准和参考标准物质的吸光度，绘制血红蛋白的标准曲线。查标准曲线可求得待测样品和参考标准物质的血红蛋白含量（叽）计算参考物质的回收率。1.6.1.2.5 注意事项1.6.1.2.5.1 不要将试剂放在聚乙烯瓶内，以免因乱离子与其反应而使试剂作用降低。1.6.1.2.5.2 不宜直接使用消光系数方法计算血红蛋白的
13、含量，因为仪器的波长准确与否、仪器的灵敏度和线性等因素均直接影响测定结果。1.6.1.2.5.3 每次测定时，在不同间隔反复测定血红蛋白标准液和参考标准物质（低、中、高3个浓度）1.6.1.3 数据处理及结果判定实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算尸值，产值VR）.3，结论：各组均数间差异无显著性；尸值2R）05,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。结果判定受试样品组与对照
14、组比较，血红蛋白浓度升高经统计处理差异有显著性，且受试样品组前后升高幅度平均达到IOgZL以上，判定该实验结果阳性。1.6.2红细胞内游离原口卜琳测定1.6.2.1 原理血红蛋白的合成过程中，幼红细胞中的原吓咻在血红素合成酶的作用下与铁结合，当铁供应不足时，红细胞内的原口卜咻乃以游离形式累积起来超过正常水平。因此，检测红细胞内游离原吓咻（FreeerythroCyteproIoporphyrin,FEP）的含量是检查缺铁性红细胞生成的有效方法。血液样品经生理盐水稀释后，分别以乙酸乙酯：乙酸混合液（4:1）和0.5N盐酸提取分离血中游离原口卜咻，在一定波长下测定其原吓咻的荧光强度而定量。1.6.
15、2.2 仪器162.2.1荧光分光光度计或930型荧光光度计。1.6.2.2.2离心机。1.6.2.2.3混旋器。1.6.2.3试剂1.6.2.3.1 肝素抗凝剂一支12500单位的肝素以0.9%生理盐水稀释至25mL（ImL=500单位）1.6.2.3.2 5%（W/V）硅藻土生理盐水悬浊液称取5g硅藻土加0.9%生理盐水至100mL01.6.23.34:1乙酸乙酯和乙酸混合液。1.6.2.3.40.5NHC1-1.6.23.5原口卜咻标准液。1.6.2.3.5.1原吓咻标准贮备液（50mgL）称取5mg原口卜咻,加4mL无水乙醇使之溶解，以1.5NHCI稀释至100mLo1.6.23.5.
16、2原口卜咻标准中间液（LOmgZLJ取2mL原吓咻贮备液，以乙酸乙酯与乙酸（4:1）混合液稀释到IOomL。1.6.235.3原11卜咻标准应用液（0.1mgU取ImL原口卜咻中间液，以乙酸乙酯与乙酸（4:1）混合液稀释到IOmL。1.6.2.4 魁步骤试剂样品管空白管标准管肝素（mL）0.100.100.10全血（mL）0.02水(mL)0.020.025%硅藻土悬浊液（mL）0.150.150.15原吓咻标准应用液（mL）0.5乙酸乙酯与乙酸（4:1）混合液（mL）443.5注：按上表依次加入各种试剂，在加入乙酸乙酯与乙酸混合液前，用混旋器混合已加入的混合液，然后边混合边加入乙酸乙酯与乙酸
17、混合液。离心15分钟，将各管上清液分别倒入IOmL比色管中，每管加4mL0.5N盐酸，振摇5分钟静止使之分层，将上层溶剂抽出弃去，测定盐酸液的荧光强度（30分钟内比色）1.6.2.5 荧光测量1.6.2.5.1 若使用日立MPF-4型荧光分光光度计测定条件为激发波长为403nm,姗Onm：发射波长为605nm,狭缝为5nm,液槽为ICm厚石英槽。1.6.2.5.2 若使用国产930型荧光光度计测试，条件为激发滤光片420,荧光滤片550,灵敏度1X500,满度开关开至最大,液槽为Icm厚石英槽,检出灵敏度为0.01g4mL。在不同量原口卜咻（Og,0.01g,0.03g,0.05g,0.07g
18、,0.1g）呈线性关系。1.6.2.6 计算样品荧光强度-空白荧光强度100血中原叶琳含量（g,L全血）三X标准管原口卜噂含量（g）10标准管荧光播度-空白荧光强度样品取样量（mL）1.6.2.7 数据处理及结果判定实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值，产值R）W结论：各组均数间差异无显著性：产值2R）o5,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。结果判定受试样品组与对照组
19、比较，红细胞内游离原11卜咻降低经统计处理差异有显著性，即可判定该实验结果阳性。1.6.2.8 注意事项1.6.2.8.1 荧光强度随时间延长而逐渐衰退，但30分钟内基本稳定。162.8.2加乙酸乙酯-乙酸混合液时，一定要边混合边加入，否则影响测定结果。1.6.2.9滤纸法测定：将滴有20微升血点全部剪下放入试管中，同时取同样大小空白滤纸放入标准管和空白管中，各管均加入5%硅藻土悬浊液0.2亳升，振荡后放置过夜，以下步骤同直接法。计算：FEP（微克/100亳升全血）=CBXA/DXIOoA=标准管原口卜咻含量(0.02毫克)B二标准管荧光强度-空白管荧光强度C=血样荧光强度-空白管荧光强度D=
20、取样量1.6.3红细胞压积测定：使用全自动血细胞分析仪进行。数据处理及结果判定同“162.7”。1.7 数据处理和结果判定实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值，产值2.1.2 儿童纳入标准：6岁儿童Hb70gL-110gL;7-18岁青少年80gL-120gL.2.2 受试者排除标准2.2.1 合并有心、脑血管、肝、肾、消化道等严重疾病及精神病患者。2.2.2 过敏体质或对该受试样品过敏者。2.2.3 严重贫血患者。2.2.4 短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。2.2.5 未按标准服用受试样品、资料不全影响功效或安全性判断者。2.3
21、 试验设计及分组要求采用自身和组间两种对照设计。按受试者的血红蛋白水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如性别、年龄、经济状况等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试者不少于50例。2.4 受试样品的剂量和使用方法试食组按推荐服用方法、服用量服用受试产品，对照组可服用安慰剂或采用空白对照，也可服用具有同样作用的阳性物。受试样品给予时间30天，必要时可延长至120天。试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。2.5 观察指标2.5.1 安全性指标2.5.1.1 一般状况（包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等）2.5.1.2 血、尿、便常规检查2.5.1.3 肝、肾功能检查
22、（儿童受试者不测定此项）2.5.1.4 腹部B超、胸片、心电图检查（各项指标在试验前检查一次，儿童受试者不测此项）2.5.2 膳食调查于试验开始前、结束前进行三天的询问法膳食调查，观察饮食因素对试验结果的影响。2.5.3 症状观察食欲不振、乏力、烦躁、头晕、眼花、精神不集中、心慌、气短等。2.5.4 功效性指标儿童观察指标：血红蛋白、红细胞内游离原吓咻成人观察指标：血红蛋白、血清铁蛋白、血清运铁蛋白饱和度/红细胞内游离原吓咻2.5.4.1 血红蛋白测定：见1.6.1。2.5.4.2 血清铁蛋白测定（放射免疫法J2.5.4.2.1 原理人血清中的铁蛋白（SF）与加入的I标记的SF竞争性地与抗铁蛋
23、白抗体结合。用第二抗体分离结合部分，分别测定总放射性与沉淀物放射性计数。依据标准SF试剂作出标准曲线，从而可在曲线上查出相应样品血清的SF浓度。*SF+Ab-*SF-Ab+*SF+SFtISF-Ab+SF*SF：标记的铁蛋白SF：未标记的铁蛋白Ab：抗铁蛋白抗体2.5.422仪器离心机、Y-射线计数仪。2.5.4.23试剂25I血清铁蛋白放射免疫分析试剂盒.02.5.424操作步骤2.5.4.2.4.1操作步骤：铁蛋白测定操作程序和试剂用量（mL）（见下表）2.5.424.2 绘制标准曲线以各标准管的B/Bo%作纵坐标，标准铁蛋白浓度为横坐标（对数边）作标准曲线。样品或质控由B/Bfl%值从曲
24、线上查到相应的含量。组别标准曲线组待名称(T)(NBS)(B0)零(B)测总计数值非特异管标准管标准管管温育液0.20.1铁蛋白标准0.1待测血样或质控0.1铁蛋白抗体0.10.10.1叼一铁蛋白0.10.10.10.10.1充分摇匀,37C,温育1.0小时分离试剂0.50.50.50.5充分摇匀，室温15分钟3500转/分，离心15分钟，弃上清液，测沉淀计数2.5.424.3 结果计算三献结合率：NBS(CPm)一本底(cpm)NBS(%)=T(cm)本底(cpm)l%结合率：BO(cpm)-NBS(CPm)B()/T(%)=T(CPm)本底(cpm)l%械管(样品、质控)结合率：B(cpm
25、)-NBS(CPm)B/B。(%)=B0(cpm)-NBS(CPm)100%2.5.424.4 注意事项本实验为抗原抗体结合反应，操作时要注意防止可引起抗原、抗体失活的因素(如高温、冰冻等)测定时，蛾止液体岫，以第奇洞位粉藻使雌增氤离心后，抽去上清液时勿将平铺在管底的免疫复合物吸起，否则测定结果不准确。非特异管、零管是为鉴定试剂是否符合规定而设立的。血清铁蛋白浓度也可用酶联免疫吸附法测定。具体测定方法按相应试剂盒说明书进行。2.5.43血清运铁蛋白饱和度测定2.5.4.3.1原理血清中加入过量的铁，使血清中的运铁蛋白全部与铁结合，达到饱和，过剩的铁用碳酸镁吸附除去，然后按测血清铁的方法，测定总
26、结合的铁量，即为总铁结和力。从中可计算出未饱和铁量及血清运铁蛋白饱和度。254.3.2血清铁测定血清铁(SI)是指存在于血清中与血清运铁蛋白结合的铁，它以高铁的形式附着在血清Pl球蛋白的转递蛋白上，成人正常值为50-184g100mL0缺铁性贫血时常低于50g100mL,当血红蛋白浓度降低不明显时，血清铁已减少，被认为是早期缺铁性贫血诊断依据之一。2.5.4.3.2.1格天青B彼盐比色法格天青B铁盐作为显色剂测血清铁，比过去多采用的联毗咤等作为显色剂有较高的灵敏度，其克分子吸光系数在630nm波长下为1.68IO5Lmo,cm,m一血浆取样量（mL）2.5.4.33总铁结合量测定2.5.433
27、.1试剂2.5.43.3.1.1铁标准液2.5.4.3.3.1.1.1 铭精B钱盐法2.5.4.3.3.1.1.1.1 Ofe（3mmolL）取1.176g硫酸亚铁铁（6分子结晶水）置蒸饰水中，加50mL浓硝酸混匀反应10分钟，用蒸锵水定容至100OmL2.5.4.3.3.1.1.1.2 工（做（30molL）取IOmL贮备液，用蒸储水定容至100OmLo2.5.4.3.3.1.1.2原子吸收分光光度法2.5.4.33.1.1.2.1贮备液：取LOOOOg纯金属铁，用盐酸或硝酸溶解后，用0.1N盐酸稀释到1000mL,移入聚乙烯塑料瓶内，存放4。C冰箱，ImL含Img铁。2.5.43.3.1.
28、1.2.2工作液：取IOmL贮备液，用0.1N盐酸定容至100mL,ImL=100pg铁。2.5.43.3.2轻质碳酸镁（AR）（或碱式碳酸镁）其质量应符合要求。2.5.4.33.3实验步骤2.5.4.3.331应用格天青B钱盐方法测总铁结合量取0.1mL血清放入尖底离心管，加60molL铁标准液OJmL充分混合，室温放置15分钟。再加4-5mg轻质碳酸镁，放置15分钟，混合3-4次。然后以3000转/分离心58分钟，取上清液0.1mL按铭天青B钱盐比色法测血清铁的步骤进行操作，计算。254.3.3.3.2原子吸收分光光度法测总铁结合量取1.0mL血清，加铁标准液（20gmL）0.5mL,充分
29、混合，放置15分钟。力口15Omg轻质碳酸镁，充分混匀1分钟以上，放置30分钟，混合34次。离心10分钟，取上清液ImL按原子吸收分光光度法测血清铁的操作步骤进行消化，测定，计算。254.3.3.4计算2.5.4.33.4.1血清总铁结合量可用（mg100L）表示。2.5.433.4.2未饱和铁量=血清总铁结合量一血清铁。血清铁血清蛋白运铁蛋白饱和度（）=XlOO血清总铁结合量2.5.43.4数据处理及结果判定实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值，尸值尺3,结论：各组均数间差异无显著性；尸值2尺.os，P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比
30、较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。2.5.4.4红细胞内游离原叶咻：见1.6.2。2.5.5结果判定受试样品组与对照组比较，血红蛋白升高且平均升高幅度210gL,血清铁蛋白增加，血清运铁蛋白饱和度升高，红细胞游离原吓咻降低，经统计处理差异有显著性，即可分别判定该指标结果阳性。2.6数据处理及结果判定试验数据为计量资料，可用，检验进行分析。凡自身对照资料可以采用配对，检验，两组均数比较采用成组，检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当
31、的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行/检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用检验或秩和检验；但变异系数太大（如CV50%）的资料应用秩和检验。结果判定改善儿童缺铁性贫血：试验前后自身比较利试验后组间比较，血红蛋白、红细胞内游离原吓咻二项指标差异有显著性；同时，试食组自身前后比较，血红蛋白平均升高幅度10gL,可判定受试样品具有改善缺铁性贫血的作用。改善成人缺铁性贫血：试验前后自身比较和试验后组间比较，血红蛋白指标差异有显著性；同时，试食组自身前后比较，血红蛋白平均升高幅度21OgL,血清铁蛋白、红细胞内游离原吓咻/血清运铁蛋白饱和度二项指标中一项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血的作用。
