《保健食品功能检验与评价方法（2023）有助于增强免疫力.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《保健食品功能检验与评价方法（2023）有助于增强免疫力.docx（15页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、保健食品功能检验与评价方法（2023年版）有助于增强免疫力1.1 试验项目1.1.1 体重1.1.2 脏器/体重比值测定：胸腺/体重比值,脾脏/体重比值1.1.3 细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型变态反应实验1.1.4 体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测定1.1.5 单核一巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清实验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验1.1.6 NK细胞活性测定1.2 试验原则1.2.1 所列指标均为必做项目。1.2.2 采用正常或免疫功能低下的模型动物进行实验。1.3 结果判定有助于增强免疫力判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核一巨噬细胞功能、NK细胞活
2、性四个方而任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有有助于增强免疫力作用。其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性,可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核一巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核一巨噬细胞功能结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。有助于增强免疫力检验方法1 .实验动物推荐用近交系小鼠，18-22g,单一性别，每组10-15只。2 .剂
3、量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。免疫模型动物实验时间可适当延长。3 .实验方法3.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验可任选下列方法之一3.1.1 MTT法3.1.1.1 原理当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞发生增殖反应，活细胞特别是增殖细胞中的线粒体水解前可将MTT（一种淡黄色的哇氮盐）分解为兰紫色结晶，其光密度值能反映细胞的增殖情况。3.1.1.2 仪器和材料RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2-航基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉
4、素、刀豆蛋白A（ConA）盐酸、异丙醇、MTT、Hanks液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4）纱布或200目筛网、24孔培养板，96孔培养板（平底）手术器械、二氧化碳培养箱、酶标仪、721分光光度计、超净工作台、高压灭菌器、无菌滤器。3.1.1.3 实验步骤3.1.1.11 试剂配制完全培养液RPMU640培养液过滤除菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氮酰胺（20OmmOI/L）青霉素（100UmL）邮素（100gL）及5X10SmOIzL的2硫基乙醇，用无菌的ImolZL的HCl或Inlol/L的NaC）H调PH至7.07.2,即完全培养液。ConA液用双蒸水配制成100gmL的溶液，过滤
5、除菌，在低温冰箱（-20）保存。无菌Hanks液用前以3.5%的无菌NaHCO3调PH至7.27.4。MTT液将5mgMTT溶于ImLPH7.2的PBS中，现配现用。酸性异丙醇溶液96mL异丙醇中加入4mLImoVL的HCl,临用前配制。3.1.13.2 脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液平皿中，用保子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过漉，或用4层纱布将脾磨碎，用Hanks液洗2次，每次离心IOmin（100Or佃in）然后将细胞悬浮于ImL的完全培养液中，用台的兰染色计数活细胞数（应在95%以上）调整细胞浓度为3X106个mL3.1.13.3 3淋巴细胞增殖反
6、应将每一份脾细胞悬液分两孑血入24孑阴养板中，每孔ImL,一孑血75LCOnA液（相当于75gmL）另一孔作为对照，置5%CO2,37oCCO2孵箱中培养72ho培养结束前4h,每孔轻轻吸去上清液0.7mL,加入0.7mL不含小牛血清的RPMlI640培养液，同时加入MTT（5mgmL）50L孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入ImL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以57Onm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，721分光光度计上在波长570nm测定OD值。3.1.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，
7、但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值Foq5,结论：各组均数间差异无显著性；F值2Foq5,PW005,用多个实验组和一个对照组间为数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。3.1.1.5 注意事项本实验中ConA的浓度很重要，过低不能刺激足帔的细胞增殖，过高会抑制细胞增殖，不同批号
8、的ConA在实验前要进行预试，以找到最佳浓度。3.1.2同位素掺入法1.1.1.1 理T淋巴细胞在有丝分裂原PHA、COnA等的刺激下，产生增殖反应，DNA和RNA合成明显增加，如在培养液中加入3H胸腺嗑咤核甘(5H-TdR)则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞的放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。1.1.1.2 仪器和材料RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2.疏基乙醇(2MEX青毒素、链霉素、刀豆蛋白A(ConAlHanks液PBS缓冲液pH727.4YH-TdRM烁液2,5二苯基驰坐(PPo)0.5gJ,4双“0.25g、5苯基恶哇基).笨PoPOP)二甲苯500mL混匀200目筛网
9、，96孔培养板（平底），手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁仪、多头细胞取集器、49型玻璃纤维滤纸。1.1.1.3 实验步骤1.1.1.3.1 脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量无菌Hankk液的小平皿中，用银子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hankt液洗3次，每次离心IOmin（100OrZmin）然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上）最后用RPMI1640完全培养液将细胞数调成5X1（）6个nL.1.1.1.3.2 淋巴细胞增殖反应将脾细胞悬液力11J96孑L培养板中，200L孑L,所份三H胞悬液分装6个孑L,3孑
10、UJrIConA（5gmL）另3个孑L不力口COnA作为对照。置5%Co2,37C培养72h,培养结束前6h,每孔加入3H-TdR20L,使其终浓度为（3.718.5）X104BqmL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中,加入7mL闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数（CPm）1.1.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值，F值尸03,结论：各组均数间差异无显著性；F值2FoO5,PW005,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或
11、方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。以每分钟脉冲数（CPm）表示增殖程度，用刺激指数（SI）来表示SI=实验孔cp对照孔cpm受试样品组的SI值显著高于对照组的Sl值，即可判定该项实验结果阳性。3.2迟发型变态反应（DTH）可任选下列方法之一3.2.1 二硝基氟苯诱导小配DTH（耳肿胀法）3.2.1.1 原理二硝基氟苯（DNFB）稀释液可与腹壁皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。47天后再将其涂抹于耳部进行抗原攻击，使局部肿胀，一般在抗原攻击后2448h达高峰，其肿胀程度可以反应映迟发型变态反应程度。3.
12、2.1.2 材料DNFB,丙的、麻油、碳化领、打孔器。3.2.1.3 实验步骤12.1.3.1试剂配制DNFB溶液DNFB溶液应新鳏涮，称取DNFB50mg,置清洁干燥小瓶中，将预先配好的5mL丙酮麻油溶液（丙酮：麻油=1：I）倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用250L注射器通过瓶盖取用。1.1.1.1.2 致敏每鼠腹部皮肤用硫化铁脱毛或剃毛，范围约女mX女m,用DNFB溶液50L均匀涂抹致敏。1.1.1.1.3 DTH的产生与测定5天后，用DNFB溶液10L均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。3.2.1.
13、4 数据处理与结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值Ros,结论：各组均数间差异无显著性；F值2FoO5,P005,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的重量差值显著高于与对照组的重量差值，可判定该项实验结果阳性。3.2.1.5 注意事项操作时应避免DNFB与皮肤接触。3.2.2绵羊红细胞（SRBC）诱导小鼠DTH（足跖增厚法）3
14、.2.2.1 原理SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，4天后，当再以SRBC攻击时，攻击部位出现肿胀，其肿胀程度可反映迟发型变态反应程度。322.2 材料游标卡尺（精密度0.02mm）SRBC、微量注射器（50L1322.3 实验步骤1.1 .2.3.1致敏小鼠用2%（vv）SRBC腹腔或静脉注射免疫，每只鼠注射0.2mL（约1XIO8个SRBC）1.2 .3.2DTH的产生与测定免疫后4天测量左后足跖部厚度,然后在测量部位皮下注射20%（vv）SRBC,每只鼠20L（约IX108个SRBC）注射后于24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。1.3 .2.4数据处理和结果判
15、定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值同.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值FoO5,PW005,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比莪方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。322.5 注意事项测量足跖厚度时，最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部，但不要加压，否则会影响测量结果。攻击时所用的SRBC要新鲜（4保存
16、期不超过1周）322.6 生成细胞检测（Jenle改良玻片法）322.6.1经过绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使分泌抗体的脾细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数可反映抗体生成细胞数。322.6.2 和材料二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、玻片架、200目筛网、SRBC,辛琳（豚鼠血清）Hankk液、RPMI1640培养液、SA缓冲液、琼脂糖。333实验步骤3.3.3.1SRBC绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌椎形瓶中，朝个方向摇动，以脱纤维，放入4C冰箱保存备用，可保存2周。333.2制备补体采集豚鼠血，分离
17、出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将ImL压积SRBC力叭到5mL豚鼠血清中，4C冰箱放置30min,经常振荡，离心取上清，分装，-7OeC保存。用时以SA缓冲液按1：815稀释。玻片涂膜在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖（0.5g琼脂糖加双蒸水至IOomL,加热溶解）干后可长期保存备用。3.333免疫动物取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000rmin）IOmin,计数细胞，每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC51O7-2XO8个。也可将压积SRBC用生理盐水配成2%（vv）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射02mL3.3.3.4 脾细胞悬液制备将SRBC免疫45天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，
18、放在盛有Hanks液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，离心（100OrZmin）IOmin,用Hank,s液洗2遍，最后将细胞悬浮在5mLRPMII640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5xl06个/mL。也可将细胞悬浮在8mLHanks液。3.3.3.5 空斑的测定将表层培养基（Ig琼脂糖加双蒸水至100mL）加热溶解后，放4550C水浴保温，与等量pH7.27.4、2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管0.5mL,再向管内加50L10%SRBC（vv,用SA缓冲液配制）20L脾细胞悬液（5106个mL）或25L脾细胞悬液，迅速混匀
19、，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1L5h,然后用SA缓冲液稀释的补体（1：8）加入到玻片架凹槽内，继续温育lL5h后，计数溶血空斑数。3.3.4数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值，F值FoO5,结论：各组均数间差异无显著性；F值2Foo5,PWO（）5,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；着变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用空斑
20、数/IO、脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。3.4血清溶血素的测定可任选下列方法之一。3.4.1 血凝法3.4.1.1 原理用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体（溶血素利用其凝集SRBC的程度来检测溶血素的水平。3.4.1.2仪器和材料SRBC,生理盐水、微量血凝实验板、离心机3.4.1.3 实验步骤3.4.1.3.1 SRBC绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4C冰箱保存备用，可保存2周。3.4.1.3.2 免疫动物及血清分离取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000rmin
21、)IOmin。将压积SRBC用生理盐水配成2%(vv)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。45天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约Ih,将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000rmin离心IOmin,收集血清。3.4.1.3.3 反应用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100L,再加入100L0.5%（vv）的SRBC悬液，混匀，装入湿涧的平盘内加盖，于37温箱孵育3h,观察血球凝集程度。3.4.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值Fqq5,结论：各组均数间差异无显著性：F
22、值2Foq5,PW005,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。血清凝集程度一般分为5级（O-IV）记录，按下式计算抗体积数，受试样品组的抗体积数显著高于对照组的抗体水平，可判定该项实验结果阳性。抗体水平=（S+2S2+3S3nS.）式中1、2、3n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。0级红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清晰。I级红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周
23、有少量凝集的红细胞。II级凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。III级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。IV级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。3.4.1.5 注意事项血清稀释时要充分混匀。最后一个稀释度应不出现凝集现象。3.4.2 半数溶血值（HGQ）的测定3.4.2.1 原理用SRBC免疫动物后，血清中出现SRBC抗体（溶血素）在补体参与下，与SRBC一起孵育，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量。14.2.2仪器和材料721分光光度计、离心机、恒温水浴、SRBC,补体（豚鼠血
24、清）SA缓冲液、都氏试剂（碳酸氢钠1.0g、高铁制化钾0.2g、制化钾0.05g,加蒸缁水至100OrnD3.423实验步骤3.4.2.3.1SRBC绵羊端期橄!礼将羊血放入存螭珠的灭菌锥形瓶中朝一个方用用动，以脱纤维，放入4冰箱保存备用，可保存2周。3.423.2制备补体采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将ImL压积SRBC力叭JU5mL豚鼠血清中，放4C冰箱30min,经常振荡，离心取上清，分装，一70七保存。用时以SA液按1：8稀释。3.4.2.3.3免疫动物及血清分离取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000rmin）IOmino将压积SRBC用生理盐水配成2%（v
25、v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。45天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约Ih,使血清充分析出，2000Ivmin离心IOmin,或6000rmin,4min,收集血清。3.423.4溶血反应3.4.2.3.4.1分光光度计法取血清用SA缓冲液稀释（一般为200500倍）将稀释后的血清ImL置试管内，依次加A10%（vv）SRBC0.5mL,利本ImL（用SA液按1:8稀释）另设不加血清的对照管（以SA缓冲液代替）置37C恒温水浴中保温15-30min后，冰浴终止反应。2000rmin离心IOmin。取上清液ImL,加都氏试剂3mL,同时取10%（vv）SRBC0.25mL加都
26、氏试剂至4mL充分混匀，放置IOmin后，于54Onm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。3.4.2.342酶标仪法设样品孔和空白对照孔，样品孔：取血清用SA缓冲液稀释（殿200500倍）每孔加入稀释后的血清50L;空白对照孔：每孔加入50LSA缓冲液，再依次加入10%（vv）SRBC25L,补体50L（用SA翻按1:8稀释置37匕恒温培养箱中保温30min,冰浴终止反应，1500rmin水平离心IOmin,然后样品孔和空白对照孔各取上清液50L加入另一个96孔培养板内，加都氏试剂150L.同时设半数溶血孔，加入10%（vv）SRBC12.5L再加都氏试剂至200L,用震荡器充分混匀，放置
27、Iornin后，于54Onm处用全自动酶标仪测定各孔光密度值。3.4.2.4数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值，F值Rh）5,结论：各组均数间差异无显著性；F值eFos,PW（三）5,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。显著高于对照组的HC5O,可溶血素的量以半数溶血值（Ha（I）表示，按下列公式计算，受试样品组的HC5O判定该项实验结果阳性。HC5O=样品光密度值
28、X稀释倍数SRBC半数溶血时的光密度值3.5小鼠碳廓清实验3.5.1 原理在一定范围内，体内碳颗粒被清除速率与血碳浓度呈指函数关系。以血碳浓度对数值为纵坐标，时间为横坐标，两者呈直线关系。此直线斜率（K）可表示吞噬速率。动物肝、脾重量影响吞噬速率，一般以校正吞噬指数a表示。3.5.2 仪器和试剂721分光光度计、计时器、血色素吸管、印度墨汁、Na2CO3353实验步骤3.5.3.1 溶液配制注射用墨汁将印度墨汁原液用生理盐水稀释34倍。Na2CO3溶液取OJgNazCCh,力啜辑水至100mLo3.5.3.2 注射墨汁按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁（IomIkg）待墨汁注入，立即计时。3
29、.533测定注入墨汁后2、IOmin,分别从内眦静脉丛取血20L,并立即将其加到2mLO.l%Na2CO3溶液中。用721分光光度计在600nm波长处测光密度值（OD）以Na2CO3溶液作空白对照，也可用随标仪在600nm波长处测光密度值（ODX将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的-9-吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。lgOD-IgOD2K=吞噬.指数a=体重X3T肝重+脾重3.5.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F
30、值Foq5,结论：各组均数间差异无显著性：F值2Foo5,PW0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计：对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。3.5.5 注意事项静脉注入碳粒的量、取血时间、取血量一定要准确。墨汁放置中，碳粒可沉于瓶底，临用前应摇匀。使用新的果汁时，应在实验前摸索一个最适墨汁注入量，即正常小鼠在20min内不易廓清。3.6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验”任选下列方法之一。361小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（滴片法）3.6.1.1 原理
31、利用巨噬细胞对光滑表面如玻璃表面具有粘附的特性，将含有巨噬细胞的腹腔液滴于载玻片上，加入鸡红细胞，孵育一定时间后，冲洗掉未粘附的细胞，固定染色，在显微镜下计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，据此判定巨噬细胞的吞噬能力。3.6.1.2 仪器和材料：显微镜、37C孵箱、计数器、手术器械套、注射器、滴管、胶头吸管、吸耳球、教玻片、染色槽、试管3.6.1.2.1 玻片处理重复使用的载玻片要经洗液浸泡、洗净晾干后，经酒精浸泡过夜。用前以纱布拭干或晾干，否则会影响巨噬细胞粘附和镜检。在玻片上标号，用3%琼脂（配方见试剂部分）每个玻片上划两个圆圈（圆圈必须全封闭，否则液体会流出）晾干备用。3.6.
32、1.2.2 搪瓷或塑料盒：内垫半湿纱布（用温水湿透，置于孵箱内备用）纱布一定要平整。3.6.1.2.3 试剂配制方法3.6.1.2.3.1 3%琼脂的配制：取琼脂3g,加水IoomL,加热煮沸至透明，加入1%的浪甲酚紫指示剂1一2滴。3.6.1.2.3.2 PBS缓冲液的配制方法：KH2PO46.66g,Na2HPO412H2O6.38g,将上述试剂溶于IooOmL蒸馈水中调PH值至7.2即成。3.6.1.2.3.3 1%鸡红细胞悬液：实验前取鸡颈静脉或动脉血，置于盛有玻璃珠（20个左右）的三角瓶内，连续顺一个方向充分摇动5IOmin,除去纤维蛋白，4C冰箱保存。实验前用生理盐水洗涤3次，15
33、00rmin,离心IOmin,弃去上清，按血球压积用Hanks液配制成1%的红细胞悬液。3.6.1.2.3.4 Giemsa染液：a.取Giemsa染料0.5g,中性甘油33mL,甲醇33mL。先将Giemsa染料置清洁研钵中，加甘油后，研磨片刻，倒入棕色瓶内，放置556（C水浴箱内2小时，不断摇匀，再加入甲醇摇匀，保存备用。b.稀释姬姆萨氏染色液：使用时，用pH6.8的缓冲液8份，加姬姆萨氏染色液原液1份，即成应用液。3.6.1.2.3.5Giemsa染液脱色液:配制方法：甲醇20mL,蒸储水80mL。混合后加2NHCk滴即成。3.6.1.3 实验步骤小鼠巨噬细胞的激活:实验前4天给每只小鼠
34、腹腔注射2%压积羊血红细胞0.2mL。用颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的HankS液4mU只，轻轻按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，用胶头吸管吸取腹腔洗液2mL于试管内（或用注射器）用ImL加样器吸取腹腔洗液0.5mL加入盛有05mL1%鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。用注射器（装大针头）吸取0.5mL混合液，加入玻片的琼脂圈内。放置孵箱内37C孵育1520分钟。孵育结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醉液中固定1分钟，Giemsa液染色15分钟。用蒸偏水冲洗干净，晾干，用40X显微镜计数吞噬率和吞噬指数。吞噬率为每100个巨噬细胞中，吞噬鸡红细胞的巨
35、噬细胞所占的百分率；吞噬指数为平均每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数。3.6.1.4 数据处理及结果判定见362.4.3.6.1.5 注意事项颈椎脱臼处死小鼠勿用力过大，防止腹腔内血管和内脏破裂出血影响实验结果。放滴片的搪瓷盘内应保持一定的湿度，以防液体干燥。孵育后的标本冲洗次数的差别不宜太大，更不要直接冲在有细胞的部分。实验操作过程中应严格掌握时间。在镜下计数细胞时要数完一个视野后再换另一个视野。362小鼠腹腔巨噬细胞百噬鸡红细胞实验（半体内法）3.6.2.1 原理在体内腹腔巨噬细胞能吞噬鸡红细胞。据此判断巨噬细胞的吞噬功能。3.6.2.2 仪器和材料显微镜、鸡红细胞、丙的、甲醇、生理盐水、Gi
36、emsa染液。3.6.2.3 步骤3.6.2.3.1 鸡红细胞悬液制备取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶中，朝一个方向充分摇动，以脱纤维。用生理盐水海条23次，离心（2000rmin,IOminJ去上清，用生理盐水配成20%（vv）的鸡红细胞悬液。3.6.2.3.2 吞噬功能测定每懿腔注20%鸡红细胞悬液ImL。间隔30min1.5h,颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于僦板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL,转动鼠板Imin。然后吸出腹腔洗液ImL,平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿沙布的搪瓷盒内，移置37C孵箱温育30min0孵毕，于生理盐水中漂洗,以除去未贴片细胞。晾干，以1:1丙酮甲醉
37、溶液固定，4%(vv)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min,再用蒸储水漂洗晾干。油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。吞噬百分率()=吞噬鸡红细胞的巨噬细艘InnX100计数的巨噬细胞数丁小生如被吞噬的鸡红细胞总数吞噬指数=计数的巨噬细胞数在计数时，应同时观察鸡红细胞被消化的程度。借以判定巨噬细胞吞噬与消化功能，通常分为4级：I级：未消化。被吞噬的鸡红细胞完整，胞质浅红或浅黄带绿色，胞核浅紫色。11级：轻度消化。胞质浅黄绿色、胞核固缩呈紫蓝色。III级：重度消化。胞质淡染，胞核淡浅灰色。IV级：完全消化。巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐，胞核
38、隐约可见。16.2.4数据处理及结果判定以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨腕细胞的吞噬能力。吞噬百分率需进行数据转换，X=Sin-、：，式中P为吞噬百分率，用小数表示。在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值boa,结论：各组均数间差异无显著性：F值2Foq5,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计：若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的吞噬百分率或吞噬指数与对照组比较，差异均有显著性，方可判定该项实验结
39、果阳性。3.7NK细胞活性测定可任选下列方法之一3.7.1 乳酸脱氢酶(LDH)测定法3.7.1.1 原理正常情况下，活细胞胞浆内的含有LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDH释放到细胞外。LDH可使乳酸锂脱氢，进而使NAD还原成NADH,后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化四氮哩蓝(INT)INT接受K被还原成紫红色甲朦类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定。3.7.1.2 仪器和材料酶标仪、YAC-I细胞、Hanks液(pH7.27.4)RPMI1640完全培养液、乳酸锂或乳酸钠、碘硝基氯化峡嘴(INT盼嗪二甲酯硫酸盐(PMSNADO.2molL的Tri
40、S-Hel缭腋(pH8.21%NP4O或2.5%TritOn3.7.1.2.1 实验步骤3.7.1.2.2 1.DH基质液的配制乳酸锂510-2moVL碘硝基氯化四氮哇蓝(INT)6.610-4mokL吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)2.8Xl(r4molL氧化型辅酶I(NAD)1.310oV将上述试剂溶于0.2moVL的Tris-HCl缓冲液中(pH8.2)3.7.1.2.3 靶细胞的传代(YAC-I细胞)实验前24h将靶细胞进行传代培养。用前以Hanks液洗3次，用RPMH640完全培养液调整细胞浓度为4XIO5个/mL。3.7.1.2.4 脾细胞悬液的制备(效应细胞)无菌取脾，置于盛有适量无菌
41、HankS液的小平皿中，用镶子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，或用Hankl液洗2次，每次离心IOmin(100or/min)弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入05mL2倍Hankk液及8mLHanks液，1000rmin,IOmin离心；或采用NECI-Tris红细胞裂解液裂解红细胞，离心Iomin(100ormin)弃红色上清。用ImL含10%小牛血清的RPMIl640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上)最后用RPMlI640完全培养液调整细胞浓度为2X107个/mL。3.
42、7.1.2.5 NK细胞活性检测取靶细胞和效应细胞各100L(效靶比50:1)力叭U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100L,靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP4O或2.5%Triton各100L;上述各项均设三个平行孔,于37、5%CO2培养箱中培养4h,然后将96孔培养板以1500rmin离心5min,每孔吸取上者100L置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100L,根据室温不同反应310min,每孔加入ImoizL的HCI30L,在酶标仪490nm处测定光密度值(ODh按下式计算NK细胞活性，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项实验
43、结果阳性。NK细胞活性()=反应孔0d自然释放孔DX1(X)%最大释放孔OD自然释放孔OD3.7.1.3 数据处理及结果判定NK细胞活性需进行数据转换，X=SizJ7,式中P为NK细胞活性，用小数表示，然后再进行方差分析，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值Foo5,结论：各组均数间差异无显著性；尸值2Foos,PW0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组
44、的NK细胞活性，可判定该项实验结果阳性。3.7.1.4 注意事项靶细胞和效应细胞必须新鲜，细胞存活率应大于95%。反应时环境温度应保持恒定。1.DH基质液应临用前配制。在一定范围内，NK细胞活性与效靶比值成正比。一般效靶比值不应超过10003.7.2 同位素3H-TdR测定法1.3.7.2J原理将用同位素3H-TdR标记的靶细胞与淋巴细胞共同培养时，靶细胞可被NK细胞杀伤。同位素便从被杀伤的靶细胞中释放出来，其释放的量与NK细胞活性成正比。通过测定靶细胞H-TdR的释放率即可反应NK细胞的活性。3.7.2.2仪器和材料液体闪烁仪、多头细胞取集器、二氧化碳培养箱、峭-TdR、RPMI1640完全
45、培养液、Hanks液（PHZ27.41YAC-I细胞、TritonX-100372.3.实验步骤3.7.2.3.1靶细胞的标记取传代后24h生长良好的YAC-I细胞（存活率95%）按IXIO6AnLYAC-I细胞悬液加3H-TdRIOuCi进行标记，于37C、5%CO2培养箱中培养2h,每30min振荡1次。标记后的细胞用培养液洗涤3次，重悬于培养液中，使细胞浓度为1IO5个/mL。3.7.232脾细胞悬液的制备（效应细胞）无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用摄子轻轻将牌撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心IOInin（100OrZmin）然
46、后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上）最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1X10?个/mL。3.723.3NK细胞活性测定在96孔培养板中每孑加100L标记的靶细胞，魁孔加I00L效应细胞，空白对照孔加100L培养液，最大释放孑5口I00L2.5%TritonX-100。每个样品设3个复孔，置5%CO237培养箱内温育4h,用多头细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，用液体闪烁仪进行测量。按下式计算NK细胞活性：实验孔CpmNK细胞活性（）=（1）100%空白对照孔Cpm最大释放孔Cpm3.7.2.4数据处理及结果判定NK细胞活性需进行数据转
47、换，X=SilrI/，式中P为NK细胞活性，用小数表示。在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值产值同。5,结论：各组均数间差异无显著性；F值2FoO5,P005,用多个实验组和一个对照组间为数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，可判定该项实验结果阳性。4.有助于增强免疫力结果判定有助于增强免疫力判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核一巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有有助于增强免疫力作用，其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳
