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1、大豆蛋白glycinin和conglycinin经口诱发五指山小型猪过敏反应的实验研究黄琼I徐海滨基金项目：国家科技部973计划(NO:2007CB 109207)通讯作者简介：徐海滨，男，研究员，博士生导师，研究方向：食品毒理学，转基因食品安全性评价， E-mail： hbxu 1231602(3)I广东省疾病预防控制中心2中国疾病预防控制中心营养与食品安全所2杨杏芬I黄俊明I于州2高苑2刘珊2广东省疾病预防控制中心毒理实验所，广州510300摘要：目的建立适用于评价食物中潜在致敏物质的五指山小型猪大豆球蛋白(IlS)和B伴球蛋白(7S)经口致敏模型。方法20头1.5月龄五指山小型猪分别摄入
2、含0%、4%US、8%11S4%7S、S%7S大豆蛋白的饲料，通过胃肠道致敏(O-IOd)和反笈经口激发(16T8d,31d)诱导致敏反应，从皮肤试敏反应、血清TgG.IgE和组胺水平、小肠组胺含量和肥大细胞数量、外周血淋巴细胞亚群和细胞因子表达等方面进行模型评价和可能致敏机制的探讨。结果接受IIS或7S经口致敏的仔猪皮肤试敏试验呈不同程度的阳性反应；致敏组仔猪血清中TgGTgE抗体和组胺含量在第19d即激发期后达到最高，三个时间点仔猪血清中IgG、IgE抗体和组胺含量两两呈正相关；实验第19d4%IlS和4%7S致敏组血清中IgG、IgE抗体和组胺含量均高于对照组，第32d4%IlS和4%7
3、S致敏组IgE抗体和4%IlS致敏组IgG抗体和组胺含量均高于对照组；空肠组胺含量与十二指肠组胺、同肠组胺含量呈正相关，而与空肠粘膜层和粘膜下层肥大细胞数呈负相关；4%7S致敏组空肠组胺高于对照组，4%IIS致敏组空肠粘膜下层肥大细胞数目低于对照组；实验第19d4%7S致敏组血清中IFN-含量较对照组降低；实验终期8%IlS致敏组外周血CD4+CD8+比值较对照组升高，以上差异比较或相关性检验均有显著性意义(P0.05或0.01)。结论由大豆蛋白glycinin和B-Conglycinin诱发的五指山小型猪食物致敏模型属IgE介导的I型过敏反应类型，可用于食物潜在致敏性的评价。关键词：食物过敏
4、大豆球蛋白大豆伴球蛋白五指山小型猪ExperimentalstudiesofanaphylacticreactionsinWZSminipigorallyinducedbysoybeanglycininand-conglycininHUANGQiong,XUHaibin9YangXingfen,HuangJunming,YuZhou,GAOPeng,LiuShanInstituteofToxicology,CenterforDiseaseControlandPreventionofGuangdongProvince,Guangzhou510300,ChinaAbstract:Objective
5、:Toestablishglycinin(IlS)and-conglycinin(7S)allergyminipigmodelstoevaluatepotentialallergensinfood.Methods：Twenty1.5monthsoldWZSminipigswererespectivelygastricSensitized(O-IOd)andoralchallenged(16-18d,31d)withdietscontaining0%,4%US,8%11S,4%7Sor8%7Ssoybeanproteinstoinduceanaphylacticreactions.Skinpri
6、cktest,serumIgG,IgEandhistaminelevels,smallintestinehistamineconcentrationsandmastcel1numbers,bloodlymphocytesub-setsandcytokinesexpressionsweremeasuredtoevaluatethemodelandinvestigatepossiblemechanisms.Results:Positiveskintestresponsesatdifferentdegreeswereobservedin1ISand7Ssensitizedgroups.Theseru
7、mIgG,TgEandhistaminelevelsallreachedthepeakafterIlSor7Sgroupswereoralchallengedat19d,andeverytwoofthemweresignificantlyandpositivelycorrelated(P0.01).Comparedwiththecontrol,serumIgG,IgEandhistaminelevelsof4%HSand4%7Sgroupsat19d,serumIgEof4%IlSand4%7Sat32d,andserumIgGandhistaminelevelsof4%HSat32dwere
8、allsignificantlyincreased(P0.05or0.01).Thejejunumhistaminelevelwaspositivelycorrelatedwiththatoftheduodenumandileum,butnegativelycorrelatedwiththemastcellnumbersinthejejunummucosaandsub-mucosa(P0.01).Comparedwiththecontrol,thejejunumhistaminelevelof4%7Sgroupwasincreasedandthemastcellnumberinthejejun
9、umsub-mucosaof4%1ISgroupwasdecreased(P0.05or0.01).Comparedwiththecontrol,theserumIFN-contentof4%7Sgroupwassignificantlydecreased,whiletheCD47CD8*ratioof8%HSgroupwassignificantlyincreased.Conclusion:TheWZSminipigallergymodelinducedbysoybeanglycininand-conglycininbotharetypeIhypersensitivitymediatedby
10、IgE,whichcanbeusedtopredictthepotentialallergenicityofnovelfoods.Keywords:FoodAllergyglycinin-conglycininWZSminipig食物过敏是指食物引起的一类非毒性不良反应，主要临床表现为皮肤、胃肠道或呼吸道症状，严重者可导致全身系统性过敏症状如休克等甚至死亡。目前估计全世界范围内有3%4%的成年人和6%的儿童患有食物过敏,因此食物过敏已成为国际社会关注的一个食品安全问题1。而且，食物过敏流行趋势仍在继续增长，尤其是在“西方化”社会，原因可能与“卫生假说”和全球范围内食物消费多样性的增加相关2。已
11、知的常见食物致敏原包括大豆、花生、甲壳类动物、鸡蛋、牛奶、鱼、坚果和小麦等。目前对于食物过敏反应的治疗尚无十分有效手段，个体预防性回避接触确认或可疑致敏原仍然是防治关键。除上述传统的八大类食物致敏原外，食物中潜在致敏物质的评价也是预防的关键。随着基因工程技术的迅猛发展，转基因食品的出现不仅带来了新一轮的食品工业革命，同时也掀起了关于其安全性的质疑热潮，关于其潜在致敏性的评价从一开始就是人们关注的热点。1996年NOrdIee报道了转入巴西坚果基因后的大豆可诱发对巴西坚果过敏的人发生过敏反应3,此案例在一定程度上促进了致敏性鉴定成为转基因食品安全性评价中必不可少的重要内容。目前，关于转基因食品致
12、敏性评价通常采用综合、逐步及个案分析的原则4,常用的分析方法为1996年国际食品生物技术委员会(IFBC)和国际生命科学学会(ILSD联合制订的判定树分析法（decisiontreeapproach）5,该方法包括结构分析和氨基酸序列比较；理化特性研究如消化稳定性和热稳定性；蛋白质在食物中的含量及消费模式等。2001年,FAO/WHO在该判定树的基础上进行了发展和完善,主要增加了靶血清筛选试验和动物模型试验内容,并认为食物致敏动物模型是评价其潜在致敏性最直接的方法,再次肯定了开展食物致敏动物模型研究的必要性和意义6。研究至今，食物致敏动物模型主要用于验证过敏性疾病的免疫治疗物质有效性和预测对人
13、类有潜在致敏性的物质两方面。动物种属涵盖啮齿类动物和非啮齿类动物，前者主要是小鼠、大鼠和豚鼠，后者包括狗、猪等。目前国际上尚未建立食物致敏性评价的标准动物模型，实际上任何单一模型不可能适用所有目的，至今也未发现一种可重复23种以上常见食物致敏原在人体引起的过敏反应的动物模型，关键是要根据研究目的和各种模型特点进行针对性地选择7。比如啮齿类动物模型多适用于分子和细胞水平的致敏机制研究，并具有费用少、易获得和易操作的优势。而在进行过敏性疾病研究，如更多关注皮肤、呼吸道和胃肠道等临床症状的改变则可考虑使用大动物如猪和狗等作为模型。近年来，一些非啮齿类大动物如猪和狗等，由于诸多优势逐渐被食物致敏研究者
14、们关注和利用：（1）确认的对天然过敏食物的临床和免疫学表现；（2）与人类更近似的解剖学、生理学和营养需要特点；（3）与人类更近似的免疫病理学、机制学和治疗性干预策略；（4）可反复多次胃肠道内窥镜观察；（5）可获得大量免疫器官或细胞进行研究；（6）可减少单位体重致敏原使用浓度。当然这些大动物研究的一些缺点也是易见的，主要集中在种属与品系的有限性，基因敲除品系尚不可得，免疫方法研究试剂的缺乏，大体积而小样本以及较为昂贵的费用等方面8。与其它动物模型比较，猪在研究致敏原发病机理和免疫应答等方面有许多更重要的优点。除与人类在胃肠道生理学和黏膜免疫发育上的极相似性外，同时由于具有先天免疫反应活性使得利用
15、猪进行免疫反应评价更为有效和可能。目前进行猪的致敏模型研究只在个别实验室开展9T0,利用猪致敏模型筛选转基因食品的潜在致敏性尚未见研究报道。大豆作为一种优质植物性蛋白原料，已被广泛应用食品和动物饲料生产中，但由于其含有的多种抗营养成分影响了其进一步的开发和利用。大豆抗原蛋白是大豆中最主要的抗营养因子，而大豆球蛋白（glycinin）和-伴球蛋白（-conglycinin）是两种免疫原性最强的大豆抗原蛋白，诸多研究对两者的免疫血特性和致敏性作了广泛研究，现已明确这两种蛋白是引起动物大豆过敏反应的主要物质11。本研究以我国自主驯化和成功培育的实验用近交系五指山小型猪作为模式动物，采用大豆抗原蛋白g
16、lycinin和onglycinin作为阳性致敏物，建立适用于评价食物中潜在致敏物质致敏性的大动物模型，旨在为我国建立转基因食品致敏性的评价程序提供一定理论依据和实验参考。1材料与方法1.1 大豆抗原蛋白纯化的大豆提取物glycinin（以下简称IIS）和。-CongIyCinin（以下简称7S）蛋白由中国农业大学食品科技学院郭顺堂教授惠赠（专利号为：No200410029589.4）,冷冻干燥磨粉后4C冷藏保存，经SDS-PAGE电泳和考马斯亮兰染色后分析，纯度分别为85%和80%。1.2 动物和饲料20头（4窝义5头）五指山小型猪仔猪由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供，仔猪30d时开始
17、逐步进食无大豆配方饲料，45d完全断乳进入全封闭式猪舍，舍温2628C,相对湿度为5070%,昼夜光照交替时间为1212h,送排风为集中自动控制，仔猪单笼(70CmX60CIn)饲养，不锈钢可拆洗式料槽，自由饮水，每口按体重3%分两次(8:00am/16:00Pm)给予无大豆配方饲料，适应4d后进入实验。无大豆配方饲料参照NRC(1998)配制，为玉米一脱脂奶粉一酪蛋白型半纯和日粮，配方和营养成分分析结果(由中国农业大学饲料分析测试中心检测)见表1。表1玉米一脱脂奶粉一酪蛋白型半纯和猪饲料和营养成分分析结果配方组成含量()玉米粉60.2脱脂奶粉9.5乳清粉10.0酪蛋白11.6猪血浆喷雾蛋白粉
18、3.0鱼粉3.0石灰0.5磷酸氢钙1.0食盐0.2预混料(仔猪用)I1.0合计100营养成分化学分析(测定值)粗蛋白21.42钙1.11磷0.75赖氨酸1.64能量(MJzKg)13.801预混料为每千克饲料中含：维生素A,10,(X)OIU;维生素D，l,500IU;维生素E,30IU;维生素K3,2.5mg;维生素B,1.5mg;维生素B2,IOmg;维生素B6,IOmg;维生素Bi2,0.05mg;叶酸，LOmg;维生素B?,0.5mg:维生素Bs,30mg;泛酸，20mg;铜,20mg;铁，100mg;锌，11Omg;毓40mg;硒,0.3mg;碘,0.5mg;1.3 主要仪器设备和试
19、剂离心机(BeCkman),称重仪(HUAPU,XK3119L),天平(SartoriUSBS423S),流式细胞仪(BDBiOSCienCeSFACSCalibur),酶标仪(Sunrise),电动组织分散仪(PRO200),封片机、切片机、包埋机(SAKURA),染片机(Leica),显微镜用测微尺(上海珊科仪器厂)，多聚赖氨酸玻片(Coming)舒泰100(Virbac),酸性土豆磷酸酶(Sigma-aidrich),组胺(Sigma-aidrich),甲苯胺蓝(Amresco),猪淋巴细胞分离液(天津激洋，TBD),小鼠抗猪PE-CD8aIgG2a、小鼠抗猪PE-CD4aIgG2b、小
20、鼠抗猪FITC-CD3IgG2a(BDBiosciencesPharmingen)o1.4试验设计按照体重将20头仔猪随机分至五组，分别为对照组，4%11S,8%11S,4%7S和8%7S致敏组。四个试验组仔猪在进入实验的第0IOd(致敏期)和1618d(激发期)分别进食将大豆抗原IIS和7S蛋白按每日总饲料量的4%或8%比例均匀拌入的无大豆配方饲料，对照组饲喂无大豆配方饲料；各组仔猪在实验第Ild和19d分别中期采血一次，实验第25d进行皮肤试敏试验；在实验第31d(16:00pm),致敏组分别饲喂4%或8%glycinin和B-COngIyCinin蛋白进行末次激发，实验第32d(8:Oo
21、am)进行终期采血、麻醉、放血处死和解剖取材。1.5 样本采集和麻醉解剖中期采血：实验第Ud、19d仔猪保定后，经颈静脉丛采取4-5ml非抗凝血，室温静置2h后分离血清(250OrPm,20min),分装后-80冻存。终期采血：仔猪保定后，经颈静脉丛采取4-5ml非抗凝血和3-4ml枸椽酸钠抗凝血，前者室温放置2h后分离血清(25OOrPm,20min),分装后80冻存；后者用猪淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞后-80冻存。麻醉：进行皮肤试敏试验和终期解剖时采用0.05mlkg舒泰100耳后肌注诱导麻醉，浓度根据动物麻醉后反应程度进行适度调整。终期解剖：仔猪麻醉后经心脏放血处死后，剖开腹腔
22、，游离胃肠组织，取十二指肠、空肠、回肠(近回盲褶34Cm处)各1cm,放入Carony飞固定液(无水乙醇:氯仿:冰醋酸=6:3:1)中固定，用于肥大细胞组织化学染色；另取各肠段12cm,用生理盐水灌注冲洗后，滤纸吸干水份，立即放入液氮中保存，用于肠道组织中组胺含量的测定。1.6 一般情况观察(腹泻、体重和饲料摄食情况)仔猪进入试验后，第0714,21,28,31d清晨空腹称重，计算仔猪饲料利用率，观察并记录试验全期各组仔猪的活动和腹泻情况。1.7 皮试试验第25d进行皮肤试敏试验。各组仔猪按体重比例给予舒泰100麻醉后，针刺测试麻醉程度，无明显反应后，仰卧位保定，暴露腹部白色皮肤，用动物专用剃
23、毛剪小心备皮，油性记号笔划出皮试范围并分区标记，分别在相应区域皮内注射0.1mlPBS,PAP,组胺，包被液(抗原蛋白溶剂)，US,7S溶液(考马斯亮兰法定蛋白含量约Img),在注射后30min内，观察并测量各点皮肤上的红斑直径，若其大于5mm,可认为皮肤过敏反应阳性。1.8 血清IgG和IgE抗体分析血清总IgG和IgE抗体含量采用猪IgG和IgEELISA试剂盒(RaPidBioLab,Calabasas,CA,USA)分析。1.9血清和肠组织组胺含量分析血清组胺含量采用猪血清组胺ELlSA试剂盒(RaPidBiOLab.Calabasas,CA,USA)分析；肠组织组胺含量采用猪组织组胺
24、ELISA试剂盒(R叩idBioLab,Calabasas,CA,USA)分析。肠组织匀浆制备：准确称取0.40.5g小肠组织，至IOml离心管中剪碎，加入5倍体积PBS溶液，在电动组织分散仪上冰浴匀浆，然后4C,IOQOOrpm离心IOmin,取上清液-20C保存次日分析。1.10 血清ThlTh2细胞因子含量分析血清中Thl(IL-2,IFNPY)/Th2(IL-4,IL-10)细胞因子含量采用猪IL-2,IFN-y,IL-4,IL-IOELISA试剂盒(BiOSoUrCe,CamariHo,CA,USA)进行分析。1.11 外周血淋巴细胞亚群(CD3/CD4/CD8)的表达分析外周血淋巴
25、细胞亚群(CD3CD4/CD8)的表达采用流式细胞仪(FACSCalibur,BD,USA)进行CD4+CD3和CD8CD3比例分析，小鼠抗猪CD8a和CD4a均为PE标记，小鼠抗猪CD3为Frre标记。终期解剖后取抗凝外周血分离出单个核细胞(PBMC)后，-80C保存，集中分析前解冻，计数，染色标记，避光4孵育30min后，冷PBS洗涤1次(250g,5min)后上机分析。1.12 肠组织肥大细胞计数12肠组织肥大细胞组织化学特殊染色：Carony、固定液中固定后的肠组织进行常规取材、包埋、切片，选择经多聚赖氨酸处理的载玻片制片，常规脱腊、止水后进行甲苯胺蓝染色(0.5%,30min),0.
26、5%冰醋酸分化数秒，冷风吹干，二甲苯透明，中性树脂封片。肥大细胞计数：每张片子各随机选取10处肠绒毛黏膜和黏膜下层，显微镜下200X放大观察，经物镜测微尺校正，利用网型目镜测微尺(025mm2/分格，100分格)，分别计数每平方亳米肥大细胞数目。1.13统计分析所有数据采用SPSSll.O进行单因素方差分析(One-WayNOVIeSl)、非参数检验(Mann-WhitneyleSt)和双变量相关分析(Bivariatecorrelationtest)。2结果2.1 一般情况观察(腹泻、体重和饲料摄食情况)与对照组比较，大豆抗原蛋白致敏组体重和饲料利用率有下降趋势(结果未显示)，但差异比较无统
27、计学意义。少数致敏组仔猪出现轻度腹泻症状。2.2 皮肤试敏试验结果皮肤试敏试验结果见图1所示，皮试15min后，对照组仔猪皮肤(C)除组胺点出现红斑外，其余各点均无明显反应；4%IIS致敏组仔猪皮肤(B)和4%7S致敏组仔猪皮肤（八）在IIS和7S点红斑反应较其余对照点重，而较组胺点轻。结果表明未接受IIS或7S经口致敏的仔猪，皮肤试敏试验呈阴性反应,而接受IIS或7S经口致敏的仔猪皮肤试敏试验呈不同程度的阳性反应(未全部图示)。A： 4% 7S致敏组B： 4% US致敏组C：阴性对照组1. PBS:磷酸盐缓冲液一阴性对照2. PAP:土豆碱性磷酸酶阴性蛋白对照3. HIS:组胺阳性对照4.
28、CA:包被液溶剂对照5. 1IS:-Conglycinin6. 7S:glycinin图1glycinin和B-CongIycinin诱发仔猪皮肤过敏反应结果2.3血清IgG和IgE抗体和组胺含量分析(PlIMU)I lmj)s1000. 0800. 0600. 0400. 0200. 0180. 00160. 00140. 00120. 00100. 0080. 0060. 0040. 0020. 00不同采血时间点（lid、19d、32d）仔猪血清中IgG、IgE抗体和组胺含量见图2,表34所示。从表2可见，第19d4%IIS和4%7S致敏组血清中IgG、IgE抗体和组胺含量（对数转换值）
29、均高于对照组,第32d4%llS和4%7S致敏组IgE抗体和4%IIS致敏组IgG抗体和组胺含量（对数转换值）均高于对照组，差异比较有显著性意义（P0.05或0.01）；从表3可见，三个时间点仔猪血清中IgG、IgE抗体和组胺含量两两呈正相关，相关性检验有显著性意义（P0.01）;从图2可见，三个时间点仔猪血清中IgG、IgE抗体和组胺含量在第19d即激发期后达到最高，且此点仔猪血清中IgG、IgE抗体和组胺含量从高到低依次为4%7S、4%US、8%7S、8%IIS致敏组和对照组。0.0Iid19d32d0.0Ild19d32d0.00Ild19d32d图2不同时间仔猪血清中总IgG（八）、I
30、gE（B）和组胺（C）水平表2不同时间仔猪血清IgG、IgE抗体和组胺含比较（对数转换值）GroupLogioIgGLogIolgELogioHistamineIld19d32dHd19d32dHd19d32dcontrol2.190.162.29O.252J70.12I.65O.141.77O.231.640.071.33().141.450.231.310.074%IlS2.430542.910.21a2.610.12a1.890.512.380.18a2.130.17a1.570.512.060.18a1.810.18a8%IlS2.340.172.450.452.160.391.79+
31、0.171.930.411.64+0.39I.470.171.610.411.320.394%7S2.140,362950.31a2.490.141.650302.45030b2.O1O.13a1.33O.3O2.130.30b1.680.128%7S2.400.152.610.322.39O.291.960.152.19O.331.900.321.640.151.87O.331.58O.32One-wayANOVA：与对照组比较a:P005b:P0.01；n=4表3不同时间仔猪血清IgG、IgE抗体和组胺含的PearSOn相关分析表(n=20)FactorSerumIgESerumHista
32、mineIld19d32dHd19d32dSerumIld0.9581R: Correlation Coefficients Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).2.5 血清 Thl/Th2 (IL-2, IFN-, IL-4, IL-10)细胞因子含量分析仔猪血清中ThI/Th2 (IL-2, IFNr，IL-4, ILTO)细胞因子含量除IFN-Y含量稍高外，其余细胞因子0.1670.0490.958*0.1670.049IgG19d0.1750.888*0.3440.1750.888*0.34432d0.1190
33、.3640.771*0.1190.3640.771*SerumIld10.194-0.0521.000*0.194-0.053IgE19d0.19410.2220.1941.000*0.22232d-0.0520.2221-0.0520.2221.000*1PearsonCorrelationCoefficients*Correlationissignificantatthe0.01level(2-tailed).2.4肠组织组胺含量分析和肥大细胞计数终期解剖后仔猪肠组织十二指肠、空肠和回肠组胺含量及粘膜层和粘膜下层肥大细胞数结果见表4-5。从表4可见，4%7S致敏组空肠组胺高于对照组，4%I
34、lS致敏组空肠粘膜下层肥大细胞数目低于对照组，差异比较有显著性意义(P0.05或0.01)；从表5可见，空肠组胺含量与十二指肠组胺、回肠组胺含量呈正相关，而与空肠粘膜层和粘膜下层肥大细胞数呈负相关，相关性均有显著性意义(P0.01).表4仔猪肠组织组胺含及粘膜和粘膜下层肥大细胞数DuodenumJejunumIleumDuodenumJejunumIleumDuodenumJejunumIleumcontrol116.0574.6183.169.013.313.812.113.113.04%IlS129.87145.66101.585.59.08.48.86.8a7.18%IlS110.131
35、10.1373.959.39.810.710.810.99.04%7S206.18221.32b146.328.58.612.412.811.011.78%7S99.6166.0543.6910.015.113.011.514.211.2SEM18.8317.6515.970.81.00.90.70.81.0mucosa(numbers0.04mm2) SUbrnUCoSa(numbers0.04mm2)GroupIntestineHistamine(ngg)MastcellnumbersintheMastcellnumbersintheSEM平均数标准误(StandarderrOrOfthe
36、mean)Mann-WhitneyTest：与对照组比较a:P0.05b:P0.01;n=4表5空肠组胺含与十二指肠组胺、回肠组胺含及空肠肥大细胞数Pearson相关分析表(n=20)FactorDuodenumhistamineIleumhistamineMastcellnumbersinMastcellnumbersinthetheJejunummucosaJejunumsubmucosaRPvalueRPvalueRPvalueRPvalueJejunumhistamine0.6300.003*0.6820.001*-0.7350.000*-0.6220.003*含量均较低，IFN-分析
37、结果见表67。从表6可见，实验第19d4%7S致敏组血清中IFN-含量较对照组较低，差异比较有显著性意义(P0.05);从表7可见，实验第IId血清中IFN-含量与十二指肠组胺水平呈负相关，而实验第19d血清中IFN-Y含量与空肠和回肠组胺水平呈负相关，相关性检验有显著性意义(P0.05或0.01)。表6GlyCinin和B-ConglyCinin对仔猪血清IFNF表达的影响GroUPIFN-(pg/ml)IldI9d32dcontrol39.538.2751.109.6738.44IO.314%IlS38.135.3444.7783039.147.008%IlS41.1013.5955.73
38、+9.9737.117.154%7S29.59+3.4335.786.42a36.338.188%7S42.11+8.5454.61+11.2039.06+8.63One-wayANOVA：与对照组比较a:P0.05:n=4表7仔猪血清IRFy表达水平与小肠组胺含的PearSon相关分析表(n=20)FaCtorDUOdenUmhistamineIeVeIJeUnUmhistamineIeVel11eumhistamineIeVeIIFN-RPvalueRPvalueRPvalueIld-0.4730.047*-0.3760.124-0.3720.12919d-0.4360.062-0.674
39、0.002*-0.5630.012*32d-0.2420.304-0.2360.316-0.3210.168R:CorrelationCoefficients1 Correlationissignificantatthe0.05level(2-tailed).2 *Correlationissignificantatthe0.01level(2-tailed).26仔猪外周血淋巴细胞亚群(CD3/CD4/CD8)的表达分析终期解剖后仔猪外周血淋巴细胞亚群(CD3/CD4/CD8)的表达见表8,8%IIS致敏组CD3+CD4+比例较对照组升高，CD3+CD8+比例较对照组降低，而CD4+CD8+
40、比值较对照组升高，差异比较有显著性意义(P0.05)表8GIyCinin和B-congIycinin对仔猪外周血淋巴细胞亚群的影响GroupCD3+CDr(%)CD3+CD8+(%)CD4+CD8control4.03+1.3939.26+1.720.10+0.048%IlS7.30+0.85*31.59+9.88*0.25+0.09*8%7S6.35+2.0235.12+3.880.18+0.04Mann-WhitneyTest：*与对照组比较P0.05,n=43讨论小型猪属珍稀猪种，原产地主要在中国和越南，在分类学上与普通家猪相同，但由于其体型和个体差异小、发育慢、培育遗传背景一致等优点已
41、发展为适合于科学研究用的实验用猪。美国早在上世纪40年代就开始了小型猪的培育开发研究，到80年代美国、德国和日本等国家先后培育出各自的小型猪品系，并广泛应用于生物科学研究。我国小型猪品种资源丰富，具有独特的优质小型猪资源。上世纪80年代初至今，国内成功培育开发和实验动物化的品系主要有版纳微型猪、贵州小型香猪、巴马小型猪、五指山小型猪和西藏小型猪，经过选育的小型猪已初步应用于皮肤烧伤、肿瘤学、心血管疾病、遗传和营养型疾病、器官移植、疫苗研制等生命科学研究领域13。本研究采用的近交系五指山小型猪是国内较早驯化和培育的小型猪品种，近交系数高达0.979,且遗传稳定，基因高度纯合，个体间差异小14,是
42、开展食物致敏模型研究的理想小型猪品系。本研究通过经口给予五指山小型猪仔猪大豆抗原蛋白glycinin和B-Conglycinin,诱发其产生过敏反应，从皮肤试敏反应、免疫球蛋白水平、组胺含量、肥大细胞数量、淋巴细胞亚群和细胞因子表达等方面进行评价分析和作用机制探讨，旨在建立适用于评价食物中潜在致敏物质的食物致敏模型。由于IgE和组胺在IgE介导的I型过敏反应中的重要作用，目前几乎已成为评价食物致敏动物模型成功与否的标志性指标1576。从本研究仔猪皮肤试敏试验、血清免疫球蛋白和组胺含量结果分析，尤其是血清IgG、IgE抗体及组胺含量在各个体各时间点的强相关性均表明所建立的大豆抗原蛋白glycin
43、in和B-CongIyCinirl诱发五指山小型猪食物致敏模型是成立的，B-ConglyCinin较glycinin致敏性更强，可能与大豆中最主要的三种致敏原都存在于-Conglycinin组分有关17,但两者4%剂量均较8%剂量过敏反应表现明显，并不呈剂量反应关系，分析原因可能与食物致敏的特点有关，是否与大剂量抗原诱发口服免疫耐受有关也值得进一步的探讨。从实验第Ud、19d、32d的动态观察结果分析，第19d即激发期后是仔猪过敏反应最强期，可作为模型的最佳观察时点。肥大细胞是存在于胃肠道黏膜层和黏膜下层的一种免疫活性细胞，在一定条件下可以活化脱颗粒。本研究采用甲苯胺蓝作为肥大细胞的特异性染料
44、，使其胞浆颗粒染紫红色，结果显示空肠组胺含量与十二指肠组胺、回肠组胺含量呈正相关，而与空肠粘膜层和粘膜下层肥大细胞数呈负相关，相关性均有显著性意义，该结果与诸多研究结果一致18,小肠内完整肥大细胞数目与组胺含量呈负相关，即完整肥大细胞数量少，组胺含量高，其原因可能是肥大细胞增殖活化脱颗粒后，导致释放的组胺增多。仔猪肠组织十二指肠、空肠和回肠组胺含量分析结果显示，4%7S和4%IIS致敏组肠道组胺含量均高于对照组，而肥大细胞数均低于对照组，其中4%7S致敏组空肠组胺含量和4%IlS致敏组空肠粘膜下层肥大细胞数目与对照组比较，差异有显著性意义，该结果与RCikiMHehn建立的花生致敏模型表现一致
45、9,即经食物致敏原致敏后小肠组织中完整肥大细胞数目减少，炎性介质组胺释放增加，从而诱发肠道的炎性反应，但本实验中分析小肠组胺含量和肥大细胞数目的组织取材来自致敏第32d,而非第19d强致敏反应表现期的仔猪小肠，结合血清免疫球蛋白和组胺的结果，选择第19d即激发期后作为模型观察终点可能更为合理和敏感。目前认为B细胞诱导产生特异性IgE抗体过程中，两种信号的介导起到关键作用，其一是致敏原的B细胞抗原簇要特异性结合B细胞受体，其二是致敏原的T细胞抗原簇经抗原提呈细胞摄取后，通过其表面的MHCII型分子介导识别Th2细胞，产生IL-4,IL-13等Th2细胞因子，促进B细胞产生特异性IgE抗体，而Th
46、l细胞因子如n2,IFN-Y可抑制IgE抗体产生，这种因为T细胞抗原簇引起的ThlTh2失衡目前被认为是蛋白致敏的重要机制19。本研究分析了不同时期仔猪血清中ThlTh2细胞因子的表达水平，结果表明实验第19d4%7S致敏组血清中Thl细胞因子IFN-y含量较对照组较低，差异比较有显著性意义；实验第Ud血清中IFN-y含量与十二指肠组胺水平呈负相关，第19d血清中IFN-含量与空肠和回肠组胺水平呈负相关，相关性检验有显著性意义，该结果表明大豆抗原蛋白glycinin和B-Conglycinin引起的仔猪过敏反应可能与Thl细胞因子表达降低有关。而本实验仔猪血清中Thl/Th2（IL-2,IFNp,IL-4,IL-10）细胞因子含量除IFN-Y含量稍高外，其余细胞因子含量均较低，可能与本研究建立小型猪
