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1、miR-26aSNPrs7372209多态性与无精症的相关性研究目录中文题目、摘要、关键词1英文题目、摘要、关键词21前言32材料和方法33结果44讨论75结论7参考文献8总结与体会9致谢11附录12miR-26aSNPrs7372209多态性与无精症的相关性研究摘要目的：初步探究miR-26aSNPrs73722O9与无精症的相关关系。方法：利用PCR-RFLP技术，在308名(正常生育男性210名，无精症患者98名)男性中，进行miR-26aSNPrs7372209的基因频率和基因型频率的分布调查C结果:与正常对照组相比，患病实验组T等位基因频率(C=,P=),以及纯合子TT基因型频率(2
2、=,p=)和杂合子TC基因型频率降低Y=,P=),纯合子CC基因型频率升高(2=,P=),但差异不显著(P0.05)O结论：miR-26aSNPrs7372209的多态性分布可能与无精症不相关。关键词miR-26a基因；单核甘酸多态性；无精症；男性不育AssociationbetweenPolymorphismsofSNPrs7372209inmiR-26aGeneandazoospermiaAbstractObjective:ThecorrelationbetweenSingleNucleotidePolymorphism(SNP)rs7372209ofmiR-26ageneandazoos
3、permiawaspreliminarilyinvestigated.Methods:ThegeneandgenotypefrequenciesofSNPrs7372209wereinvestigatedin90patientswithazoospermiaand225normalreproductivemenascontrolsbypolymorasechainreactionandpolymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthplyphismanalysis(PCR-PFLP).Results:Comparedwiththenormalg
4、roup,thefrequencyofTallele(2=2.141,P=0.143),homozygousTTgenotype(2=0.796,P=0.372)aswellasheterozygousTCgenotype(2=0.034,P=0.854)slightlydecreaseded,thefrequencyofhomozygousCCgenotype(2=2.212,P=0.137)slightlyincreasedinazoospermiagroup,buttheirdifferenceswerenotsignificant(P0.05).Conclusion:Thepolymo
5、rphismdistributionofmiR-26aSNPrs7372209maybeunrelatedtoazoospermia.KeywordsmiR-26agene;singlenucleotidepolymorphism;azoospermia;maleinfertility1前言近些年来，社会发展迅速、环境污染日益严重、人们的生活压力不断增大，不孕症患者的发病率也不断的上升。1在中国，不孕症的发病率大约约是10%,其中男性不育症占到了30%40%,不孕症已成为一个全球性的健康问题。男性不育症的发病机制较为复杂，可为先天性或继发性泌尿生殖系统异常、精索静脉曲张、内分泌失调、性腺感染、
6、线粒体功能障碍或遗传因素，如特发性不育症,约占患者的40%,患者除精子异常外，其他均可显示正常的检查结果3。根据其异常情况，可分为弱精子症、畸形、少精子症和无精子症。15%20%的男性是由无精子症引起的，所以在众多精子异常中，导致不孕的最严重原因是无精子症。4,5omiRNAs(小分子RNA)是近几年来分子生物学研究的热点问题，miRNAs是一种单链非编码小RNA,长度约为19-25个核甘酸。研究结果表明，miRNAs不仅能够参与调控细胞增殖、分化、凋亡等一些生理过程7-8,而且它是精子发生所必需的物质，在精子发生中起着非常重要的作用。因此，miRNA在男性精子发生障碍的病因学中有着很重要的研
7、究价值。miRNA相关的单核甘酸多态性(miRNA-SNP)包括位于miRNA结合位点、miRNA编码基因和miRNA加工基因的单核甘酸多态性。miRNA-SNP的功能有两种机制：功能丧失机制和功能获得机制。研究表明，SNP位点可以通过影响miRNA引起疾病的发生和发展，与疾病或复杂性状相关的SNP位点数量众多，这些SNP位点的具体功能还需要进一步分析和研究，因此研究与miRNA相关的SNP位点具有重要意义。近几年，miRNA在男性不育中的研究越来越深入，一些miRNA被证实与精子发生有关，例如，MiCrORNA-34bc的表达与精子发生密切相关然而，大多数miRNA与生精障碍之间存在的关系需
8、要进一步去研究。MiR-26a在人类3号染色体上，参与着细胞凋亡和增殖过程，总长度为21个核苜酸UL它的表达是非特异性的，在各种组织中广泛表达。12很多研究结果表明，miR26a可以抑制肝癌、乳腺癌和鼻咽癌细胞的增殖13,14。然而，miR-26a与精子发生障碍的关系目前仍不清楚。有鉴于此，本次研究采用基因多态性检测技术研究正常男性和无精子症患者miR-26aSNPrs7372209的基因频率和基因型频率，并初步分析研究了mir-26aSNPrs7372209与男性精子发生障碍的关系。2材料和方法2.1 研究对象本研究患病实验组为90例来自附属医院收集的年龄在2540岁的无精症患者。患者离体的
9、精液经离心沉淀之后，连续3次或3次以上显微镜检无精子。实验对照组为已通过正常途径育有一子的210例年龄在2540岁的正常生育男性。2.2实验试剂（详见附录1）2.3 实验仪器和设备（详见附录2）2.4 方法2.4.1 DNA提取利用加入了200L抗凝剂的血液按DNA提取试剂盒（离心柱形）操作流程进行DNA提取，并放置Oc冰箱保存。2.4.2 PCR扩增通过查询NCBI数据库获得miR-26a基因rs7372209位点两侧的序列，由Primer5.0软件设计PCR扩增的引物。其中引物序列为5,-GCCATCACAGAGCCAaaacg-3,5,-Aggccagtcatgcttacagtcacgt
10、ggttc-3x,PCR扩增片段大小为367bp0.05),无统计学意义(详见表1)。M 123Hardy-Weinerg平衡分析显示，miR-26aSNPrs7372209的基因型分布均符合Hardy-Weinerg平衡(P0.05)。367bp228bp139bp注：M：DNA分子量标记；1：基因型TT；2：基因型CC；3：基因型TC；图l.miR-26a基因SNPrs7372209位点的电泳分型结果表l.miR-26a基因SNPrs7372209的基因型与等位基因频率在正常男性和无精症患者中的分布基因型/等位基因频率2X正常对照组(n=225)患病实验组(n=90)基因型TT110(0.
11、489)39(0.433)0.7960.372TC85(0.378)33(0.367)0.0340.854CC30(0.133)18(0.200)2.2120.137等位基因T305(0.678)Ill(0.617)2.1410.143C145(0.322)69(0.383)uruTAACATTGTCTCTAGCCCa：基因型TT；b：基因型TC;c：基因型CC图2.miR-26a基因SNPrs7372209位点的基因型测序结果4讨论随着科学界对miRNA认识的深入，人们开始研究miRNA对动物组织各种生理活动的作用。越来越多的研究表明，miRNA与精子的产生、成熟以及睾丸发育都密切相关。精子
12、的产生从精原细胞到成熟精子，任何一个阶段的调控都会影响精子的产生和成熟,每个阶段都涉及到严格的基因调控，是一个复杂的过程。l,5,6JoMicroRNA具有调节基因表达的作用，它是一个短的核甘酸序列17。研究结果表明，miRNA在不同发育阶段的精子和睾丸中表达不同，具有空间和时间特异性18,19。研究还发现睾丸组织中存在丰富的miRNA,miRNA通过调控相关表达来参与精子发生的各个阶段。miRNA通过调节初级精母细胞向精子的分化过程进而影响男性生殖系统的发育。例如，发现MiCrORNA_34bc在受精卵和成熟精子中都有不同的表达程度。来自精子的MicroRNA-34bc通过调节Bcl-2的表
13、达来调控受精卵的第一次分裂20-22。这表明miRNA的异常也许会导致男性不育和精子发生障碍。根据以前在动物中的一些研究发现，miR-26a是近年发现的一种重要的miRNA分子，miR-26a也许在精子发生中起到很重要的作用23,24,25,因此，推测miR-26a可能合精子发生障碍有密切的关系。为了证实上述假设，本次研究对98例无精子症患者和218名正常男性进行了miR-26a共同基因SNPs7372209多态性与无精子症的关系研究。结果表明,基因型频率和基因频率的SNPrs7372209miR-26a基因正常的男性合精子缺乏的病人之间没有显著差异,这表明miR-26a基因的遗传多态性rs7
14、372209没有与精子缺乏相关性,表明miR-26a基因rs7372209可能不会影响精子缺乏患者的易感性。本研究第一次分析了无精子症合miR-26a基因rs7372209多态性的关系。结果表明miR-26a基因的SNPrS7372209多态性可能与无精子症无关。但是，这只是初步的研究结论。因为本次研究存在一些局限性，比如仅通过一项SNP研究来解释miR-26a基因与无精子症的关系是不够的。miR-26a基因的功能、表达和机制需要进一步深入研究，以更好的说清楚miR-26a基因和精子发生障碍之间的关系。另外，本次研究仅限于某区域的人群，样本量相对较小。在未来的研究中，有必要扩大样本量进行进一步
15、的检验。此外，有必要进一步探索研究对象的生活环境，比如结合环境因素分析研究对象是否有不良生活习惯，通过进一步的深入研究，以提高研究结果的准确性。5结论本研究结果显示miR-26a基因SNPrs7372209的多态性分可能与无精症不相关。这一结果表示miR-26a基因rs7372209的遗传多态性可能不影响无精症的发病易感性。参考文献马科;周燕;董弘;白瑞芳;侯东霞;周雪原;王晓华;冀小平.男性无精症或少精症患者细胞遗传学及Y染色体微缺失分析J.包头医学院学报,2022,V.36,18-19+31.温胜兰,谢诗,王志伟,等.河南汉族男性原发性不育与SHBG基因启动子(TAAAA)n多态性的关联性
16、J.郑州大学学报(医学版),2023,51(1):853BOISSIREA,GALAA,FERRIRES-HOAA,etal.Cell-freeandintracellularnucleicacids:newnon-invasivebiomarkerstoexploremaleinfertilityJ.BasicClinlAndrol,2022,27(l):l-7.4BhasinS.Approachtotheinfertileman.JClinEndocrinolMetab,2017,92(6):1995-2004.5XieC,ChenX,LiuY,etal.Multicenterstudyo
17、fgeneticabnormalitiesassociatedwithsevereoligospermiaandnon-obstructiveazoospermiaJ.JIntMedRes,2022,46(l):107-114.6刘鹤沫丽萍;黄文林.miR26a和miR939调控HlNl型流感病毒在MDCK细胞中的复制J.微生物学报,2023,v.50;No.246,124-130.7Lynam-LennonN,MaherSGReynoldsJV.TherolesOfmicroRNAincancerandapoptosis.BiologicalReviewsoftheCambridgePhil
18、osophicalSociety,2023,84(1):55-71.8SchickelR,BoyerinasB,ParkSM,PeterME.MicroRNAsikeyplayersintheimmunesystem,differentiation,tumorigenesisandcelldeath.Oncogene,2023,27(45):5959-5974.9杨海慧，支金华，吴静蕊.miRNA及其相关SNP在非小细胞肺癌预后中作用的研究概况J.生物化工,2023,3:163-166.10王凡;王磊;吴秋月;朱培冉;蒋卫军;赵果果;夏欣一;许晓风.MicroRNA-34bcrs4938723
19、位点单核甘酸多态性与男性不育的相关性研究J.中华男科学杂志,2022,v.26,40-43.11SimoniM,BakkerE,EurlingsMC,etal.LaboratoryguidelinesformoleculardiagnosisofY-chromosomalmicrodeletionsJ.internationaljournalofandrology,2022,22:292-299.12隋承光;李嘉;孟凡东;姜又红.miR26a靶向EZH2抑制肝癌HepG2细胞的增殖活性J.中国医科大学学报,2023,v.44;No.286,45-49.13LuJ,HeML,WangL,etal
20、.MiR-26ainhibitscellgrowthandtumorigenesisofnasopharyngealcarcinomathroughrepressionofEZH2J.CancerRes,2022,71(1):225-233.14ZhangB,LiuXX,HeJR,etal.PathologicallydecreasedmiR-26aantagonizesapoptosisandfacilitatescarcinogenesisbytargetingMTDHandEZH2inbreastcancerJ.Carcinogenesis,2022,32(1):2-9.15张幼怡，冯伟
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23、emalegermcellapoptosisthroughtargetingATFl.PLoSONE,2022,7(3):e33861.22 YannickR,OliverM5PapaioannouMD,etal.DicerldepletioninmalegermcellsleadstoinfertilityduetocumulativemeioticandSpermiogenicdefects.PLoSONE,2023,6(10):e25241.23孙文文,阿周存.microRNA与生精障碍的研究进展JOL.中国现代医学杂志:1-62023-12-04.24RomeroY,MeikarO,P
24、apaioannouMD,etal.DicerldepletioninmalegermcellsleadstoinfertilityduetocumulativemeioticandspermiogenicdefectsJ.PLoSOne,2023,6(10):e25241.25YanY,LuY,SunH,etal.AmicroarrayforMicroRNAprofilinginmousetestistissuesJ.Reproduction,2023,134(1):73-79.总结与体会轻轻的我走了，正如我轻轻地来；我轻轻的招手，作别西天的云彩；转眼间，自己已变成大四的学姐，自己的大学生活
25、也即将结束。恍惚间，仿佛自己又回到高中时期，每一个学生都在为了一个目标而努力，大三的暑假刚开始同学们便开始联系老师，准备自己的毕业实验，为自己的四年大学生活准备最完美的答卷，为自己这四年的大学生活画上一个完整的句号。我的论文题目是由指导老师选定的miR-26aSNPrS7372209多态性与无精症的相关性研究，miR-26a的权威资料多数是纯英文文献，生词很多，需要自己一个个单词查出来，再进行整句翻译，读得时候也是似懂非懂的。在这个阅读文献的过程中，自己才深刻的体会到英语的重要性，真的是书到用时方恨少，也明白了通过自我的努力解决问题的喜悦及成就感是其他事情无法比拟的。在进行实验过程中，因为自己
26、之前没有接触过分子实验，所以自己熟练实验操作的时间比较长。这也使我深刻认识到了自己的不足，并且在以后实验过程中我更加积极主动，明白学无止境，无论是实验操作，见解还是知识储备上我都还有很大的提升空间。在毕业论文写作过程中，让我深刻的认识到了基础学科和专业知识的重要性。刚刚开始着手写作毕业论文搜集资料时，自己是十分茫然的，不知如何下手，不知道什么样的文献是权威的。但这个问题很快就得到了解决，在专业老师和师姐的帮助下，我学会如何搜集权威资料、整理数据，同时确定了论文设计思路。我认真搜集各类相关资料，尽量多的阅读有关书籍、文献、期刊等。这个过程让我明白了交流，合作互助的重要性，也让我明白了我们不可能闭
27、门造车，要了解知识是不断更新，时代是不断进步的。当我最后完成了毕业论文所有工作之后，觉得这不仅仅是一次毕业论文的写作，因为在毕业论文实验过程中，我一次次的突破自己，不断学习，提升自己的专业技能。在实验室中我了解了许多东西，提高了我独立工作与思考的能力，增强了我的耐心和自信心，我相信这些在今后的学习工作和生活中都能给我带来帮助。离开学校完成论文，是一个终点，也是我人生的另外一个起点！我将踏上新的征程，踏上社会，继续新的旅途，新的生活。致谢时光荏苒，没想到自己已经步入了本科生涯的最后一年，回首走过的年华，心中倍感充实。落其实者思其树，饮其流者思其源。本实验及毕业论文完成，离不开的是老师一次次的指导
28、和实验室师姐热情的帮助，在这里我将给予你们最诚挚的谢意！首先，最不能忘记的是我的指导老师。这次论文完成离不开老师的悉心指导。老师在学术上的成果，在教学上的严谨赢得了学院师生的认可。能够受到这样一位一丝不苟，德才兼备的老师的指导，这本身对于我来说就是一种幸运。在老师的影响下我更应该自觉地严格地要求自己，绝不在实验上弄虚作假，做到一步一个脚印，确保实验的准确性。这次论文能够顺利完成，是老师从选题开始，每一个阶段都悉心指导，实验中遇到难题，每次询问老师时，老师不仅耐心的给我解答并且还引导自己，让自己了解更多相关知识，这对于我在后续的实验，毕业论文写作以及学习中起到了莫大的帮助。天涯海角有时尽，只有师
29、恩无穷期，你关心我们的生活，你照顾我们的感受，你指导我们的学习，张武老师感谢你四年来的教导，在你的身上我看到是什么是朝乾夕惕，你让我深刻认识到学习是自己的，不能够自欺欺人。你的认真负责让我的大学精彩不至于草草收场，谢谢你我诲人不倦的班主任。其次，实验室的学姐们，是她们让我一步一步熟悉并掌握了实验一系列的操作流程，她们倾其所能一点点的指导我，帮助我，感谢她们一直以来，不计回报的对我的指导和照顾。实验的进行和后期实验数据的统计整理以及最后论文的撰写都离不开她们的帮助，感谢你们一直以来对我的帮助和理解。都说父母是孩子的一位老师，自己能够站在大学毕业论文答辩的教室，离不开的是你们一直以来在我身后默默无
30、声的支持，希望自己将来能够成为你们的眼中“别人家的孩子”，谢谢你们，我敬重的爸妈。最后肯定是要感谢我的学校给我提供了学习和自我提升的平台，感谢各位大学任课老师对我的辛苦栽培，感谢同学们给予的帮助，感谢室友对自己坏脾气包容，谢谢你们成为我大学生涯里的一部分。不积珪步无以至千里，不积小流无以成江海，这次论文的制作体现的便是我大学四年的积累。在以后的生活中，我将更加努力，不断学习，用自己有限的能力来回馈社会。再次感谢老师和师姐以及给予过我帮助的同学们，谢谢你们！因为有你，我的大学才如此精彩！附录1组织/血液/细胞基因组DNA提取试剂盒离心柱型（北京天根生物科技有限公司）；100bpDNALadder
31、（北京天根生物科技有限公司）；PCR引物（上海生工）；TaqDNA聚合酶、dNTP、IOXBUffer（Mg2+free）（宝日医生物北京技术有限公司）；6xDNALoadingBUffer（北京天根生物科技有限公司）；冰乙酸、氢氧化钠、无水乙醇（天津富字化学试剂公司）；限制性内切酶HinfI（美国NewEnglandBioLabs公司）；漠化乙锭（美国AMRESCO生物科技公司）；二水乙二胺四乙酸二钠（北京Solarbio公司）；电泳级琼脂糖（100g）（西班牙BIOWEST公司进口分装）；三羟甲基氨基甲烷（北京Solarbio公司）；去离子水由S3-215实验室通过艾柯超纯水仪配置；自配5
32、0XTAE缓冲液和IxTAE缓冲液。附录2SIGMA台式高速离心机（美国SIGMA生物科技公司）；格兰仕微波炉（广东佛山格兰仕集团）；梅特勒托利多分析天平（METTLERTOLEDO公司）；艾柯实验室超纯水仪（成都唐氏康宁科技发展有限公司）；GeneAm9600热循环仪（美国AppliedBiosystemsr公司）;数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；低温冷冻冰箱（合肥美菱股份有限公司）；微量加样枪（德国汉堡艾本德生命科学公司）；Bio-RAD水平凝胶电泳仪（美国Bio-RAD公司）；GelDoclOO凝胶成像分析系统（美国Bio-RAD公司）；紫外透射仪（美国Bio-RAD公司）；恒温培养箱（东莞三洋电子有限公司）；SANYO高压蒸汽灭菌锅（东莞三洋电子有限公司）；旋涡震荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）
