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1、用于水质检测的微流控芯片通用技术要求（讨论稿）编制说明2024年1月1 .项目背景1.1 任务来源本标准根据标准化法、团体标准管理规定、湖北省环境保护产业协会团体标准管理办法进行制定。主要起草单位：武汉新烽光电股份有限公司、中国环境监测总站、湖北微流控科技有限公司、生态环境土壤与农业农村生态环境监管技术中心、中环联新（北京）环境保护有限公司、三峡集团科技有限公司、杭州霆科生物科技有限公司。计划应完成时间：2024年。1.2 工作过程1.2.1 成立标准编制组为了保证标准的适用性、实用性和可操作性，2023年9月组建了以生产、科研与用户为一体的标准起草小组。主要参加单位：武汉新烽光电股份有限公司
2、、中国环境监测总站、湖北微流控科技有限公司、生态环境土壤与农业农村生态环境监管技术中心、中环联新（北京）环境保护有限公司、三峡集团科技有限公司和杭州霆科生物科技有限公司。1.2.2 准备阶段2023年初，在地表水比色法检测微流控芯片技术要求起草初期，查阅了国内外的相关标准（包括行业标准和企业标准），结合现有地表水各类水质指标测标准的原理与定方法的实际情况与微流控芯片相关标准要求，对所涉及的各项技术指标进行了分析，并在行业内广泛征求意见，包括市场调查、研发、生产、质量检验和用户等。a）对标准中涉及的关键技术要素，进行了专题理论研究与专项技术论证工作。b）在标准起草过程中，对关键技术进行针对性研究
3、，以保证标准起草编制的适用性、实用性和可操作性。c）在地表水比色法检测微流控芯片技术科技创新方面进行了专项实验研究与相关开发实践工作。d）2023年9月完成了地表水比色法检测微流控芯片技术要求初稿工作。2 .标准制定的必要性分析2.1 水质检测环境影响水质参数是评估水体污染程度的重要指标,其中包括高锌酸盐指数、COD、氨氮、总磷和总氮等。这些参数的测量结果可以在一定程度上反映水体中有机物、无机物和营养物质等的存在情况，从而反映水体的污染程度和适宜度。高镒酸盐指数是用来衡量有机物氧化能力的指标，其测量值反映水体中有机物的含量，较高的值意味着有机物污染程度较高。CoD是表示单位体积水中所有可被氧化
4、物质所需的氧气量，高COD值表明水体中有更多的有机物和污染物，指示水质较差。氨氮是水体中溶解态氮的一种形式，通常来自废水排放和生物降解过程，高氨氮浓度会导致水体富营养化，引发藻类大量繁殖,造成水体富营养化和缺氧等问题。总磷是指水体中所有形态磷的总和，通常包括溶解态磷（无机磷酸盐）和悬浮态磷（有机磷物质），总磷可能来源于废水排放、农业活动等，过高的总磷浓度会导致水体发生富营养化，即水体中的营养物质过剩，促使藻类大量繁殖。随着藻类的增多，水体中产生大量有机物，在分解过程中消耗氧气，引发水体缺氧问题，威胁水生生物的生存。总氮是指水体中所有形态氮的总和，通常包括溶解态氮（亚硝酸盐、硝酸盐、镂盐等）和悬
5、浮态氮（有机氮物质）。总氮的来源主要包括废水排放、农业活动等。高浓度的总氮可以促进水体中藻类的生长，引发水体的富营养化。此外，过高的总氮浓度也可能导致水体中亚硝酸盐和硝酸盐的积累，这些物质对水生生物有毒作用，影响生态系统的平衡。然而现有的水质参数检测方法和设备普遍存在着一些问题，如需要的样品和试剂量大，产生的废液多，容易造成二次污染；不同的水质参数需要使用不同的设备进行检测，导致检测步骤繁琐；进口设备昂贵，废液处理难度大、成本高，检测成本高企。微流控芯片又称为芯片实验室，是把生化实验室分析过程的将取样消解、定量、分步混合、反应、显色和检测等操作单元微缩、集成到一张几平方厘米的芯片上，通过对微通
6、道网络内流体的操纵和控制，自动完成全部的分析检测过程。近年来随着微加工技术的飞跃发展，微流控芯片实验室以其高通量、多目标检测等突出的优点被广泛应用到医学和生物化学等领域，与常规检测技术相比，微流控芯片极大降低了试剂的消耗量，同时分析产生的废液极少，在微小范围内的能量传递、物质分散更快更均匀，热能传导快，因此反应快、效率高、污染少、成本低。2.2 相关标准和环保工作的需要HJ/T100-2003高镒酸钾指数水质自动分析仪技术要求，HJ377-2019化学需氧量（CODCr）水质在线自动监测仪技术要求及检测方法，HJ101-2019氨氮水质在线自动监测仪技术要求及检测方法，HJ/T103-2003
7、总磷水质自动分析仪技术要求，HJ/T102-2003总氮水质自动分析仪技术要求等水质自动监测仪技术要求都可以用来评估和监测水体污染程度，需要采用特定的大型自动分析仪器或在线监测仪器进行测试，这些指标的技术要求和检测方法通过标准文件进行规范，确保测试结果的准确性和可比性。但是该技术体系仍然是基于常规水质检测方法标准要求来建立的,不具备更高效和更快速，小型化和高通量，低试剂和少废液的新型环境监测要求。标准GBl1892-89、HJ828-2017、HJ/T399-2007、HJ535-2009HJ536-2009GB/T11893/989、HJ6362012规定了高镒酸盐指数、COD、氨氮、总磷和
8、总氮等重要水质参数检测的基本原理和方法，无法实现高集成、自动化、高效和低污染检测，不能满足日益复杂的水环境挑战。因此，建立微流控芯片技术的水质检测技术方法对于当前中国水环境监测与考核评价体系至关重要。3 .国内外相关分析方法研究从国内外环保监测的发展趋势和国际先进经验看，水质在线自动监测已经成为环境保护部门及时获得连续性的水质监测数据的有效手段。水质自动监测系统的应用，有助于环境保护部门建立大范围的监测网络收集水体监测数据，以确定目标区域的污染状况和发展趋势。当前，地表水水质自动监测站点所配备的检测仪器，其检测原理主要以泵阀式比色法、光度法和电极法为主。紫外-可见光光谱分析水质检测技术是通过提
9、取物质对不同波长的紫外-可见光的吸收光谱信息，利用光谱数据建立与目标参数相应的算法模型，来测定物质成分和含量。由于直接光谱法具有操作简便、分析速度快、无二次污染的特点，许多学者和仪器仪表厂家投入到了基于该技术的水质在线监测设备研制中。奥地利s:Can公司、德国ww公司、德国Go-Systemelektronik公司、加拿大SatlantiC公司以及我国浙江微兰科技、山东东润、深圳与正仪器、北京金达清创等公司先后研发了多款吸收光谱型水质在线分析仪用于总氮、氨氮、COD的检测。然而，由于直接光谱检测设备依赖的光谱数据与污染物浓度之间的数学模型易受环境因素的影响，各地的水体成分差异较大，使得模型的通
10、用性降低，检测江水、河水、湖水等复杂水体时的准确度下降，阻碍了产品的大范围推广应用，目前仅能作为自动监测站点检测手段的一种补充方法使用。由于传统的水质在线检测设备存在体积庞大、价格昂贵、制造工艺复杂等缺点，为进一步改进符合国家规定的分析方法要求的水质检测设备，国内外众多水质分析仪器厂商在检测系统方面开展了大量的研制工作。得益于微机电系统技术的进步，微流控技术可以将化学和生物领域中涉及的取样、样品预处理、生化反应、检测分析以及检测结果输出等过程全部通过微通道网络集成在一个芯片上完成，具有分析速度快、样品用量少、集成化和自动化潜力高的特点。此外，光学手段的引入使得微流控制备的芯片实验室不仅可以实现
11、绝大部分生物实验中的样品操作步骤，更能够快速的诊断和检测出样本指标。迄今为止，许多常见的生物检测应用已经被集成在微流控芯片上,如血液血浆分离，核酸放大，免疫酶联反应，以及对水质、食品安全的分析检测等方面（表1）。一些国外公司已经利用光学技术并结合微流控技术开发了多款商业化的水环境监测传感器，如表2所示。表1微流控光学传感器检测目标分析方法传感介质基底LOD二价铅比色法功能化纳米颗粒PDMS10M硝酸盐比色法显色剂PDMS0.7mgL硝酸盐比色法显色剂PMMA0.0782ppm亚珅酸盐SERS功能化纳米颗粒PDMS0.67pb硝酸盐和亚硝酸盐比色法显色剂PMMA0.02M,0.025M耐药菌比色
12、法显色剂纸10CFUZmL表2商业化水质光学传感器检测目标分析方法检测范围公司氨氮，硝酸盐，磷酸盐比色法与微流控Chemkey技术氨氮：0.01-0.8mg/L；硝酸盐：0430mg/L；磷酸盐：0.02-3mg/LHach碑试剂盒-比色法0-500ppbFondriestEnvironmental神试剂盒-比色法2-100ppbPalintest神原子荧光光谱法10ppbPSAnalytical碑，镉，格酸盐，铅试纸条1PPbChemSee硝酸盐紫外光谱28ppbOTTHydroMet众多国内外企业和学者在利用微流控技术并结合光学方法开展水质检测方面的研究取得了不小的进步,美国Hach公司采
13、用微流控专利Chemkey技术生产的SLlOOO多参数便携式水质分析仪，可以检测磷酸盐，硝酸盐，氨氮。杭州绿洁环境科技股份有限公司研发的基于微流控技术的氨氮、总氮和总磷在线监测系统性能不仅满足了国家标准，而且减少了仪器的运维频率以及运维成本。杭州毫厘科技依托Loe平台颠覆了组多重要离子的快速测定。毫厘科技开发了包括离子载体敏感膜和离子交换聚合物在内的多种新型材料来对目标离子如氨氮、硝酸盐或有机物进分离和鉴定，有针对性的通过电化学技术或光谱技术在不使任何化学试剂的情况下来完成氨氮、硝酸盐，并以此来快速确定样品中总氮的含量。4 .标准制定的基本原则和技术路线4.1 标准制定的基本原则4.2 标准制
14、定的技术路线环境保护部科技怀准司卜达任务I成立标准制定编制组国内外相关标准、规范、文 献的研究进展技术方法的文献资料和 咨询调研国内外微流捽水质段测应用情况调研初步探索性试验，明确技术路线等需改进的地方,编写开题报告和标准草案,组织开题论证确定标准制定主要研究内容和方法参照 GB11892-89、HJ 828-2017 HJ/T 3992007 HJ 535-2009 HJ536-29. GB/T 11893-1989、HJ636-2012 及 HJT1OO23 HJ 377-2019. HJ 101-2019. HJ/T 103-2003、HJ/T 102-2003 等标注.初步确定试验条件
15、参数和范用取点针对微流体的楮准控住、高温密封洎解、吸光度尿定及检测等技术关键点,开展系列试验.筛选最佳条件参数确定流体择放顺用及择放时的设 确定吸光度标定方式 备参数，筛选最隹离心的参数阶段实舱研究一提升吸光度 校测精度建立微流体精准控 制完整的参数确封容4定消器集加式 孟方 确热济度间 一定部时 确解及阶段 阶段方法验证 征求噫见二发布阶段 审和图1标准制订技术路线图5 .方法研究报告5.1 标准编制原则本标准的编制需符合国家产业政策与发展原则，本着先进性、科学性、合理性和可操作性的编制原则进行本标准的起草制定工作。本标准在起草过程中，主要依据以下标准进行编制：GBZT191包装储运图示标志
16、GBZT601化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T2828抽样标准GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T13384机电产品包装通用技术条件GB27990生物芯片基本术语GB41521-2002多指标核酸恒温扩增检测微流控芯片通用技术要求GB50073-2013洁净厂房设计规范5.2 标准主要内容5.2.1 标准的主要内容及目标本文件规定了水质检测的微流控芯片通用技术要求，包括水质检测微流控芯片的分类和命名、要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存的要求。本文件适用于水质检测微流控芯片产品。目标：将基于微流控、化学分析、光电检测及自控等技术，在微流控芯片上实现样品和
17、试剂用量少、分析速度快、集成度和自动化程度高，稳定性好，对环境友好，体积小，核心部件国产化，填补水环境质量自动监测行业空白的目标。5.2.2 方法原理及特点微流控芯片采用类似半导体的微机电加工技术在芯片上构建微流路系统，将实验与分析过程转载到由彼此联系的路径和液相小室组成的芯片结构上，加载生物样品和反应液后，采用微机械泵、电水力泵和电渗流等方法驱动芯片中缓冲液的流动，形成微流路，于芯片上进行一种或连续多种的反应。我们将实验室地表水水质分析过程的样品制备、定量、混合、反应、显色等操作单元微缩集成到一张几平方厘米的高分子材料微流控芯片上，通过对芯片微通道网络内流体的操纵和控制，在芯片预置试剂的作用
18、下，自动完成微流体水样的显色过程，显色完成后的检测液在光电比色计的测量下以朗伯-比尔定律(Lambert-BeerLaW)为基础计算出地表水中被测物质的浓度。本方法的主要技术特点在于:1 .微流控技术在水质检测领域的应用将先进的微流控技术应用于水质检测领域，把取样、高温密闭消解、定量、分步混合试剂、反应、显色和检测等流程全部集成到一张厘米级的可更换式标准化芯片上，实现了“样本进、结果出”的全自动标准化检测。不仅可完全替代进口设备，还将填补微流控技术在国内水质检测领域应用的空白，因此具有广阔的应用前景。2 .不同功能区的微型化和集成化由于水质样品需要经过高温消解、检测及废液收集等过程，因此创新性
19、地将微流控芯片进行功能化分区设计，在保证检测结果的准确性和可靠性的前提下，可实现各功能区的微型化和集成化，并且达到样品和试剂用量少、分析速度快、集成度和自动化程度高，稳定性好的效果。3 .节能、环保、安全微流控芯片耗材化，运维更简单便捷，成本低廉，试剂微量化并预置在芯片内，试剂微量的消耗保证了检测过程的温和与安全，一次性使用避免器件因重复使用造成的流路堵塞、监测过程清洗清水消耗量大等问题。且此模式下微流控芯片还将难回收和运输的废液变为易回收、易运输、易处理的固体废物，对环境几乎没有任何威胁，较好的解决了检测设备自身污染排放不可控的矛盾问题。6.检测试验及结果6.1 测试流程本标准所述地表水比色
20、法检测微流控芯片分别采用国标方法中的HJ/T399-2007快速消解分光光度法，HJ536-2009水杨酸分光光度法，GB11893-89铜酸镂分光光度法，HJ636-2012碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法。试验中，各指标化学试剂量均为50uL,水样试剂量均为350uLo在浓度检测中，不同浓度形成的颜色深浅不同，产生透光性不同，水样在不同特定波长光照射下所产生的电流值在减去无特定波长光照下所产生的暗电流值；与纯水在在不同特定波长光照射下所产生的电流值在减去无特定波长光照下所产生的暗电流值，做除法后取对数值，计算出该试剂的吸光度值。根据计算出的吸光度值，代入标定曲线公式，计算浓度值。i_IWli
21、ghtIWdaIkIrlighteIrdarkP浓度-alog(Ii)+b其中：i*ight:纯水在特定波长光照射下所产生的电流；iwdark：纯水在无特定波长光照下所产生的暗电流；ITlight：水样在特定波长光照射下所产生的电流；idark：水样在无特定波长光照下所产生的暗电流；a,b：标定曲线系数表3不同水样指标混合量指标加热定量混合氧化还原剂AA混合氧化还原剂BB混合氨氮否350UL是50UL需要50uL需要总磷125C350uL是50UL需要50uL需要COD165否是无无无无总氮125350uL是50UL需要无无6.2基本性能测试根据国标HJ6712013,总磷采用紫外加热的方法，
22、将含有机磷、聚合磷酸盐在酸性条件下经过过硫酸钾全部氧化为正磷酸盐。将正磷酸盐在酸性和睇盐环境下，与铝酸铉反应生成磷铝杂多酸，并被抗坏血酸还原成蓝色络合物，在70Onm处进行吸光度测量。根据国标HJ636-2012,总氮则在碱性过硫酸钾作用下，将含氮化合物的氮经过高温作用下转化为硝酸盐，在220nm和275nm处分别测定吸收光，根据两处光强相差推算总氮浓度。COD的测量则依据HJ/T399-2007,水样加入已知量的重铭酸钾溶液，在强酸介质中以硫酸银做催化剂，经过加热处理，在440nm或60Onm处进行吸光度测量。氨氮的检测依据HJ536-2009,在碱性介质(pH=11.7)和亚硝基铁氟化钠存
23、在下，水中的氨、镂离子与水杨酸盐和次氯酸离子反应生成蓝色化合物。在70Onm处进行吸光度测量。为降低监测成本，减小监测过程中所产生的化学废液对环境污染，及基于前期实验的研究进展，减少中间过程的氧化还原试剂量，开展微量试剂相关研究。结果表明，以纯水为极大值标定点中，对总磷：0.5mg/L、LOmg/L;氨氮：0.5mgL1.5mg/L;COD：25mg/L、50mg/L、总氮：0.5mg/L、2.0mgL,相对标准偏差见表4o表4水质检测相对标准变差试剂指标标液浓度(mgL)检测浓度(mgL)均值(mgL)相对标准偏差总磷0.50.4410.4610.5000.4890.5200.48226.5
24、11.00.9540.9911.0321.0750.9691.00424.91氨氮0.50.5010.5160.5220.4660.4880.49864.521.51.4891.4991.5021.5211.5101.50420.8COD2523.828.7928.4722.9924.2625.66210.75054.0652.3349.1449.8850.2051.1223.96总氮0.50.4430.5390.4750.4990.5110.49347.3822.0022.0511.9991.9792.0252.01121.37其检出下限分别为：总磷。02mg/L、氨氮0.02mgLCOD5
25、mgL、总氮O.lmg/L。6.3微量有效测试以国标法配制生产的氨氮、总磷、总氮、Ce)D试剂，所有的试剂体系缩小至500uLo化学试剂体系的减少，必然提高对存储试剂载体的要求；包括洁净程度，惰性材料，反应时间这些方面。微量的化学试剂与盘芯片材料的本体性质、混合时间、透光穿透性有非常大的关联。这是导致微量化学试剂测量法不好广泛应用的重要原因。其中以CoD和总氮对载体材料和检测方式要求最高。在本研究中，COD试剂与PMMA材料、生物膜、PE薄膜胶粘剂的反应变质率随接触时间长短表现为正强相关，结果见下图。oPMmMM生物瓶Time(min)结果可见，PMMA材料、生物膜、PE薄膜胶粘剂与CC)D试
26、剂在Omin-5min内反应并不明显，衰减系数1.5%、1.29%、1.33%,在5min-20min内反应强度增大，PMMA材料衰减系数42%；生物膜衰减系数18%,；PE薄膜胶粘剂在5min-14min内衰减系数68%,在14min-20min内衰减系数3.3%06.4重复性测试能长期稳定和重复性测试不同指标化学试剂浓度是微流控芯片的重要指标,基于微流控离心转移混合试剂的测定方法简单易可受控，这是方法稳定的先决条件之一。对于长期多次实验过程中，水样试定量准确，氧化还原试剂释放量充分和准确，流道不受异物堵塞，检测池透光率80%与否直接关系到连续使用稳定性。微流控芯片的材质一般是石英、玻璃、单
27、晶硅、高分子聚合物等，配套的加工方法包括机械加工法、热压法、模塑法、刻蚀法等。通过比较不同的微流控芯片材料特性，综合考虑水质检测对象、水质检测条件和加工工艺等环节，选择高分子聚合物作为微流控芯片的基底材料。通过比较当前主要使用的不同芯片雕刻工艺的优缺点，拟使用激光雕刻工艺和微机械加工工艺制作出所需要的微流道，并用表面光度仪和扫描式电子显微镜对微通道的表面粗糙度和剖面尺寸进行检测，以保证在允许的误差范围内实现微流道的高效生产和稳定使用。检测液体需要在封闭的微流道内流动，因此芯片的封装是微流控芯片制作过程中非常重要的一个环节。对液流阀模块、消解模块、快速扩增模块、试剂储存模块、样品检测模块开展功能
28、测试和键合强度测试，对比不同封装工艺的封装质量和效率，从而选择出适用的封装方法。R2 = 0 99893- y = 2 807x+(-0,03116)+R2 = 0 998- y = 2 7332x+(-0 027878)(I/6E)Uo-,l。uoJuaeea,R2=099804-y=67414+(-00072403)+R2=O99775y=6702x+(-0053242)R2=O99897-y=6.5748x+(-0.018258)oR2=O99677-y=66099x+(-0058811)TPAbsorbanceR2 = 0.9993- y = 4787.89x+(-12.1325)+R
29、2 = 0.99884- y = 4366.7622x+(-15 6469)O0 050 10.150.20.25COD Absorbance(I/6E)Uo_0r。UOJ -USBB4*R2 = O 99793- y = 33 2466+(-0 026346)+R2 = O 98414- y = 34 3055x+(0 1983)5-1 O 0 020 040 060.080.10 120 140 16TNAbsorbance实验表面不同材料工艺的微流控盘芯片材料，在30天与90天的测试数据中，氨氮和总磷的数据线性度非常稳定，偏差小于1%;CoD的石英键合法数据非常稳定，偏差在2.5%以内，
30、PMMA模塑法偏差5%以内；总氮只有石英材料可以透过22Onm光源，其波动比其他指标波动稍微大点，偏差在10%以内；不过220nm的光源本身属于紫外光，其波动范围本身也会大于其他波段光源，因此这些数据表面不同材料工艺制作的盘芯片，对微量试剂检测是有长期可重复性。以自然河道取水样作为测试样品，每隔两个小时对样品进行氨氮、总磷、CC)D、总氮，测试结果如下图所示。表明了基于微流控盘芯片水质检测方法与国标方法效果接近，两种方法有较好的一致性。氨氮指标与实际水样比对O测试浓度+标港浓度(I 6U)Uo-4u 。Uoo W 6e U(I/6UJ)Uo一JaHUJUOO -UaeeTPTest-Time(
31、2hours)总磷与0.75mgL标液比对1 06总氮与LOmg/L标液比对(I/6E)U。一.l W 。UO。W 6e (I/6E)Uo -Tuguoo W 6eQrCODTest-Time(2hours)CoD与25mgL标液比对每种指标取样20次，标液浓度数据为第三方实验室数据比对，误差范围都在10%以内，测量温度20C30C在本工作中提出的应用微流控芯片技术检测水质分析，并以实验数据证明了其可行性。这种方法成功的应用在了地表水比色的检测中，并且在有效性、重复性、长期稳定性及测量精度等方面均表现出良好的性能。使用测试样品量可缩小至400UL以内，有效地避免对环境的二次污染。更为重要的是，结合未来环境监测发展的趋势，本工作证明了水质检测微量化，盘式芯片化，无论从加工工艺、检测方式、减少废液排放上可行性良好，本标注确立的必要性充分。7标准实施建议建议本标准的性质为推荐性团体标准。企业可依据本团体标准的规定和要求在企业内部建标或对原标准进行修订，并根据团体标准实施时间要求制定企业整改和其它过渡措施。
