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1、色谱柱柱压升高的常见原因及处理办法目录1 .色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染12 .色谱柱头的填料被样品污染13 .色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出34 .流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解3色谱柱是化学分析中常用的一种分离工具，但在使用过程中可能会出现柱压升高的问题。虽然柱压在长时间使用过程中缓慢增加是正常现象，但如果柱压突然升高，则需要及时排查原因并采取解决办法。以下是常见的柱压升高原因及解决方法：1 .色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染如果确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10%的稀硝酸内超声
2、清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。色谱柱入口筛板堵塞是最常见问题之一，会导致柱压升高、色谱峰拖尾、塔板数降低等问题。通常分析的样品中微粒杂质最有可能堵塞色谱柱入口，因此分析时需要先过滤或者离心，乳浊或浑浊样品应以025m滤膜处理，也可以用针头过滤器过滤。进样器与泵密封垫的磨损也会带入微粒，在进样阀与色谱柱之间使用0.25m或0.45m的在线过滤器，通常可避免这类问题。色谱柱反压的逐渐增加通常说明在线过滤器需要更换；筛板部分堵塞或色谱柱进口处固定相塌陷会导致异常峰形。2 .色谱柱头的填料被样品污染如果确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的
3、柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。填料污染的原因剖析1）样品成分复杂，如前处理过于简单，就很容易引起强保留成分积留在色谱柱入口端，导致色谱柱压力升高，柱效下降，峰型异常，或在色谱图中出现“鬼峰”。2）蛋白类样品累积：生物类样品易在柱头端累积，导致柱压升高，柱效下降。3）其他：如胶状，絮状等样品通过过滤无法去除，也会积压在筛板和柱头端，引起柱压升高。解决方案成分复杂的样品1）在方法开发时，就尽量采用SPE小柱、萃取等方法尽量多去除一些杂质。2）使用保护柱，需要注意的是，保护柱的柱芯为耗材，不能长期使用不更换，一旦超过柱芯的保护能力，强保留物质还是会进入色谱柱，因此，要关注柱压，柱压
4、提高10%以上就建议更换柱芯。3）对于检测中药复杂成分的柱子，建议定期按色谱柱说明书的异常再生方法进行色谱柱维护，目的是定期的去用洗脱能力较强的乙懵，异丙醇去反向冲洗色谱柱，去除柱头端的强保留物质。4）如检测这类产品的色谱柱出现超压，柱效不符合等情况，建议客户先按说明书的异常再生方法进行处理。如还是不能解决，再按公司的有关规定，申请维修。蛋白类样品累积1）使用SPE等更加有效的前处理方法。2）定期进行色谱柱维护冲洗，推荐去除蛋白溶剂（乙腊水三氟乙酸=50-50-0.1）o3）使用保护柱。4）因这类原因，柱子一旦出现柱压升高，柱效下降的情况，维修后能恢复的可能性很小，所以建议客户在使用过程中去定
5、期维护，并加保护柱。其它如胶状，絮状等样品通过过滤无法去除，也会积压在筛板和柱头端，引起柱压升高。这一类，ZUi好在样品处理或工艺上去解决。3.色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶齐J,形成结晶析出如果确定是盐结晶，用o%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。色谱柱老化注意事项装填好的色谱柱连接在高效气相色谱仪上后，先试压和试漏，然后在恒温下用载气吹洗数小时，再进行分析，此过程称为色谱柱老化。一、色谱柱老化的目的：1、任何制作好的新柱，在色谱柱涂渍过程中难免柱内残留有机溶剂，任何固定液都有低沸点的不纯物，不经老化就用于分析，上述低沸点物质大量从柱中流出，会造成基线不
6、稳，有时还会污染检测器。2、促使固定液均匀牢固地分布在载体和色谱柱内壁，提高柱分离效能，消除不良影响。3、促使色谱柱内固定相排布更加紧凑和均匀，提高柱性能并使其稳定。装填好的色谱柱经过老化后，柱效和性能稳定了，才可使用。二、色谱柱老化注意事项：1、新制作好的色谱柱老化时一定不能接检测器，否则容易污染检测器。2、老化温度应高于分析使用温度25以上，但不能超过固定液允许的最高使用温度。4.流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解如果因PH值使用不当，很难恢复。因此，在使用色谱柱前，应确保流动相的PH值符合固定相的要求。影响色谱柱使用寿的主要因素流动相因素1.流动相PH不同基质的填料具有不同的P
7、H适用范围。常温下无定形硅胶在纯水中的溶解度约为100mgL-1,且在PHl9的范围内溶解的硅胶量几乎是常量，考虑到溶解速度的影响,对于硅胶基质的填料,其所能承受的流动相PH范围约为1-8。键合相硅胶填料则由于键合层的屏蔽作用，使填料对流动相的适应范围大大增加，如现在广泛使用的反相色谱填料C18(十八烷基硅烷键合硅胶)，其PH适用范围可达210。当流动相PH值超出酸性范围时，键合相易发生水解而流失；当流动相pH超出碱性范围时，会加速硅胶的溶解而释放出絮状物堵塞柱子,这两种反应均是不可逆反应，特别是在温度较高(406)的环境下，会使柱效迅速降低而报废。2 ,流动相变质当前使用最为广泛的是硅基键合
8、相填料，当以水溶液作为流动相或流动相中含有一定浓度的磷酸盐缓冲液时，水溶液中或缓冲盐溶液中会滋生出一些细菌或霉菌，从而堵塞固定相颗粒间的空隙。特别是对于多元自动比例混合的高效液相色谱仪来说，水相或缓冲盐相独立存贮，因存放时间较长而容易发生此类问题。3 .流动相纯度目前，广泛使用的填料颗粒粒径范围在310m,孔径在610nm,色谱柱在使用中会有大量的流动相通过，如流动相含有微量不溶性杂质颗粒，则很容易在柱头部位被截留，久而久之，造成色谱柱机械性堵塞，引起柱压升高而无法正常使用。4 .其它因素如，流动相的极性对柱子也有一定影响，甲醇、水、冰醋酸等极性较大的物质会破坏硅胶填料柱，正丁醇、二氯甲烷等极
9、性小的物质会破坏化学键合硅胶柱，碱性溶液会破坏阳离子交换树脂色谱柱，酸性溶液容易损坏阴离子交换树脂柱。样品因素1 .样品的溶解性样品试样在配制中，如有少量微粒未能完全溶解，则会随试样一起进入色谱柱，同样，会沉积在柱头处，造成色谱柱的堵塞。2 ,样品的纯度样品中可能含有待分析组分以外的各种组分或杂质，这些组分或杂质可能会在柱内产生不可逆吸附，从而，使固定相的活性点被覆盖，保留特性发生变化。3 .样品的化学性质待测试样中的各种组分与填料之间应具有化学稳定性，比较典型的是在使用氨基键合柱时，应避免使用含线基的化合物和流动相，如，丙酮、乙酸乙酯等，以免固定相中的NH2和醉、酮发发希夫(SChiff)缩
10、合而使固定相破坏。其它因素影响色谱柱寿命的因素很多，除流动相和样品因素外，还有其它一些外在因素，如，柱压的影响，温度的影响，色谱柱的正确冲洗，色谱柱的正确安装等。色谱柱出现问题的解决办法色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高(系统管路堵塞及压力传感器故障除外)，以下列举了部分常见原因及解决办法：1.色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染。解决方法：如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10%的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。4 .
11、色谱柱头的填料被样品污染。解决方法：如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。5 .色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出。解决方法：如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。6 .流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。解决方法：如果因PH值使用不当，很难恢复。色谱柱的八大注意事项1 ,避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此，在调节流速时
12、应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。2 .应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。3 .一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。4,选择使用适宜的流动相（尤其是pH）,以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。5,经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右。
13、6 .保存色谱柱时应将柱内充满乙懵或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。7 .色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出l2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分
14、析柱相同固定相的短柱（530mm）,可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH=2-9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。8 .新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如，ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、澳）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接
15、触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔45天开机冲洗15分钟。色谱柱不使用时应该怎样保存？如果色谱柱不使用，又该如何进行保存呢?下列方法可供参考：在柱二端包起来，放到盒子里室温避光保存。毛细管柱可以用废旧的隔垫裁成二块，分别插在毛细管二段。填充柱用小塑料袋套住，再用细金属丝扎起来。因为分析室有许多化学试剂，特别在橱内会有些气味，这样能较好保管色谱柱。放置时也要有序放置，毛细管柱还是用盒子装好以免压坏，在放置时在柱上和记录本上都做好记录。拆下后，两头用橡胶垫密封，橡胶垫原本色谱盒子就带有，如果没有，用进样垫制作一下就可以了，然后装在原来的色谱盒子里面，备注上相应的信息。通常要求放在干燥的地
16、方，下次使用时，切记进样端和出口端不能装反。高效液相色谱柱的正确使用1 .加装保护柱保护柱的作用是过滤掉来自流动相和样品的化学“拉圾”同时也可以有效除去流动相和样品中的不溶物。尽管现在的色谱仪在流动相吸入口、进样阀后部以及在色谱柱的两端都装有1、2m等不同孔径的滤器，但滤器只能除去不溶性颗粒而不能除去化学污然，因此，加装保护柱是必要的，特别是在分析中药、中成药等复杂混合物和生物样品时更是保护分析柱必不可少的措施。保护柱填料应与分析柱一致，粒径可较分析柱大。保护柱属消耗品，经过一定次数的样品分析（50100次）后，出现柱压显著升高或峰形变坏或基线漂移时，应考虑更换保护柱。2 .过滤流动相和样品流
17、动相通常由水或缓冲溶液与有机溶剂混合而成，原则上，所有经过色谱柱的流动相均应过滤，但在实际操作上应视具体情况而有所区别：当有机溶剂用色谱纯级，水用石英亚沸水或其它超纯水时，在能确保水和有机溶剂的质量且没有受到污染时，过滤并无更多实际意义。当流动相中含有缓冲盐时，则过滤是必要的，如前所述，当缓冲溶液放置一段时间（视环境温度不同而异，夏季一般不超过48h,冬季一般不超过一周后，在使用前还应重新过滤。所配制的样品试液在注入流路系统前均要经0.45m（0.22m则更好）孔径滤膜过滤。要注意区分水系和油系，二者不可混用，以防止滤膜溶解而造成污染。装流动相的容器和色谱系统中的在线滤器要定期清洗和更换，以避
18、免滤器因过载而起不到过滤作用。3 ,净化样品当样品中含有对色谱柱有损害的化学成分，如产生永久性吸附的蛋白质、糖等有机分子和强吸附性物质，以及可能对柱填料产生破坏作用的基团离子。在进样前应尽可能对样品进行分离提纯以除去多余杂质组分。4 避免过高的柱压虽然高效液相色谱柱能耐受的压力可达6000psi(磅/平方英寸)，但过高及过大的压力变化均会缩短色谱柱的寿命，避免的方法是：(1)柱压过高时，尽可能采用较小的流速，以不超过柱最大允许压力的一半为宜。(2)当流速较大时，应采取流速梯度的办法使流速分步到位。(3)使用手动进样阀时，进样阀的切换要尽可能的快。否则超过20%的压力冲击会很快使柱报废。当使用多
19、柱联用时，柱切换要避免在高压下进行。5 注意温度和酸碱度一般以硅胶为基质的色谱柱最高使用温度不超过60,以低于40C为宜，特别是在流动相PH接近使用限度时，更应降低使用温度。温度过高会加快键合相的水解和硅胶的溶解，从而，使填料性质改变，柱床塌陷，降低柱效，改变峰形。目前的键合硅胶色谱柱标示的PH适用范围可达210,但在实际使用时应避免极端的PH条件，特别是在偏碱性的条件(pH8)下使用，如必须要在极端的PH条件下使用时，可通过以下方法避免柱损害：(1)在泵和进样阀之间加装预柱(饱和柱)来饱和流动相；(2)降低使用温度；检验完毕后立即用与所使用的流动相互相混溶的“温和溶剂”彻底清洗；6 ,正确及
20、时的冲洗开始试验前，应了解柱中当前是何种溶剂。对于新色谱柱，如无特殊说明均为评价报告中所用流动相。柱中当前溶剂一定要与分析样品所用流动相互溶,如不能混溶，要用与二者均能相互混溶的第三种溶剂过渡。异丙醇是唯一能与各种溶剂混溶的试剂，可作为中介流动相使用。反相键合硅胶柱适宜的保存环境是纯甲醇，如分析用流动相为缓冲液2有机溶剂，可先用较低甲醇含量(v20%)的甲醇2水置换掉原来的纯甲醇，再进分析用流动相，以防止在柱内发生盐的沉淀；试验结束后，要及时用适当的溶剂冲洗系统并最终过渡到纯甲醇冲洗，对于含有缓冲盐的流动相，最好的办法是先用与分析用流动相组成完全相同但不含缓冲盐的溶液进行冲洗，再逐步过渡到纯甲醇冲洗。多数冲洗液体积大约为柱容积的1520倍，但最终要以基线是否平直、压力是否稳定决定。有些厂家的色谱柱标明了流动相中有机相的最低使用浓度为5%,使用时应给予注意。总之，在使用色谱柱时，要注意保持其清洁、避免样品污染、控制流动相PH值等，以避免出现柱压升高等问题。如果问题确实出现，应及时排查原因并采取相应的解决办法。
