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1、2024无创液体组织活检技术在结直肠癌筛查中的研究进展摘要结直肠癌(colorectalcancer,CRC)是最常见的消化道恶性中瘤，早期筛查与干预是降低其发病率和死亡率的有效措施。无创液体组织活检技术与传统的结肠镜检查相比，具有操作简便、成本低、并发症少、依从性高的优点，能带来更好的社会效益，是目前CRC筛查技术的研究热点与突破点。近年来，随着多组学研究技术的发展，粪便及外周血基因组、蛋白质组、微生物组检测等均被证实了在肠癌筛查中的应用潜力，许多可用于肠癌早筛的生物标志物被发现，进而涌现出大量的CRC无创性筛查的新方法。本文结合国内外文献报道，综合现有的CRC无创性早期诊断的技术，探讨其应
2、用价值，以期为进一步的肠癌早筛研究提供理论依据。、,.刖音结直肠癌(colorectalcancer,CRC)是最常见的消化道恶性中瘤，根据2020年全球统计数据，CRC的发病率和死亡率分别为10.0%和9.4%,位居所有恶，的中瘤中的第3位和第2位1随着经济的快速发展以及生活方式和饮食习惯的西方化近年来中国的CRC发病率呈快速增长的趋势，中国癌症中心最新公布数据显示，2016年中国CRC新发病例和死亡病例分别位居所有恶性肿瘤的第2位和第4位,并呈现年轻化趋势2。早期发现和干预作为肿瘤的二级预防策略是降低死亡率的最重要措施之一。大多数CRC是由良性病变发展而来的，遵循正常上皮-腺瘤-腺癌的发展
3、顺序,从瘤变进展到恶性肿瘤常需要510年不等的时间，这为CRC的早诊早治提供了重要筛查时间窗3。目前，CRC的筛查金标准为结肠镜检查与病理活检,能有效发现并诊断CRCo然而，由于肠镜检查的有创性以及检查过程给患者带来的不适感和心理恐惧，使其并不被大部分人群所接受。且肠镜检查的有效性对操作者有较高的技术要求，检查费用较高，因而推广受到极大限制。近年来，新的无创CRC筛查技术受到极大关注。01粪便隐血试验粪便隐血试验(fecaloccultbloodtest,FOBT)是目前临床推广应用最为广泛的CRC筛查方法，具有无创、成本低廉、操作方法简便、可及性高的优点。FOBT主要包括化学法(guaiac
4、fecal-occultbloodtest,gFOBT)和免疫法(immunochemicalfecaloccultbloodtests/fecalimmunochemicaltest,iFOBT/FIT随着技术的进步，近年来gFOBT产品检出CRC的性能越来越高,灵敏度50%75%,特异度96%98%4o与gFOBT相比，FIT干扰因素较少，特异性更高，检出CRC的灵敏度达到71%91%,特异度达到90%95%,而检出进展期腺瘤的灵敏度和特异度也分别达到25%40%和90%95%5o同时，已有多项在大规模人群中实施的随机对照研究报道，在人群中推行Fe)BT可以使CRC患者死亡率显著下降6。F
5、IT已经被多项指南推荐作为CRC筛查程序中的重要组成部分7。然而,FIT容易被其他消化道出血相关疾病干扰，影响其对CRC的诊断。02基因组检测技术2.1 粪便DNA检测结直肠肿瘤恶变最突出的特征就是癌基因与抑癌基因的突变和异常甲基化修饰，随着肠道黏膜表面细胞不断地脱落进入肠腔，其中带有异常遗传学和表观遗传学改变的肿瘤细胞也会一并脱落与粪便混杂。粪便基因检测通过检测粪便中DNA(stoolDNAtest,sDNA)异常信息,进而在早期甚至是癌前病变阶段识别出结直肠肿瘤。针对SDNA的研究有很多，早期研究多检测单个基因的突变或甲基化，BMP3、NDRG4sSPG20、SFRP2等基因的甲基化在诊断
6、CRC上均显示出良好的准确性，对进展期腺瘤也有一定的诊断价值8,其中，中山大学附属第六医院牵头研发的SDC2基因甲基化检测试剂盒已经在中国被批准用于CRC检测。由于结直肠肿瘤具有遗传异质性，目前尚未发现有在所有CRC中共同发生的基因改变。因而,多靶点粪便DNA试验（multi-targetstoolDNAtest,MT-sDNA）是目前sDNA检测的发展趋势。2000年有报道提出了多靶点粪便DNA检测技术,使用PCR的方法检测粪便中KRAS、APC和P53的突变、微卫星不稳定性标志物Bat-26突变以及长DNA,对CRC和直径1cm的腺瘤的灵敏度分别达到91%和82%,特异度达到93%,但该研
7、究的样本量较小9。随后，该研究进一步在多中心、更大的样本量中检测了粪便中的4个甲基化基因、KRAS突变、-肌动蛋白基因和血红蛋白在CRC和直径1cm的腺瘤的检出上分别取得了85%和54%的灵敏度以及90%的特异度，使得MT-SDNA技术得到了更大的关注10,基于上述筛查技术的Cologuard试剂盒在2014年被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于CRC的筛查，并被多项指南推荐7。有研究运用上述试剂盒开展了大型多中心的临床试验,结果与FIT对比,发现MT-SDNA检测CRC和高级别癌前病变的灵敏度分别达到92.3%和42.4%,高于FIT的73.8%和23.8%,而特异度为89.8%,略低
8、于FIT11z这项研究为MT-SDNA在将来取代FIT成为肠癌筛查首选技术的可能性提供了重要的证据。目前，MT-SDNA的应用价值已经得到了广泛的认可，但仍然缺少高级别的循证医学证据证明其可以降低肠癌的发病率和死亡率，且对癌前病变的检出率仍不理想。2.2 循环肿瘤DNA检测血浆中可检测到许多从细胞释放入血的游离DNA片段（cellfreeDNA,cfDNA),其中循环肿瘤DNA片段(circulatingtumorDNA,CtDNA)是由肿瘤组织或循环肿瘤细胞通过坏死、凋亡和主动释放等途径脱落入血的，由于其携带原发和(或)转移性M瘤的基因组和表观基因组变化，近年来受到了越来越多的关注，血浆Ct
9、DNA的检测在CRC非侵入性诊断上具有广阔的前景。与粪便检测相比，血液学筛查策略在人群中的依从性更好。然而,具有特定遗传和表观遗传改变的肿瘤相关CfDNA在背景核酸成分极其复杂的血浆或血清中占的比例相对较低，其检测存在一定的困难。随着核酸检测技术与测序技术的发展，从最早的qPCR,到现在涌现的甲基化特异性PCR(methylation-specificPCR,MSP微滴式数字PCR(dropletdigitalPCR,ddPCR)等检测微量核酸片段检测技术,使得血液中检测到的遗传信息与肿瘤组织中的一致性进一步提高，而微阵列技术和下一代测序(NGS)等高通量检测技术的应用则使癌症基因组和表观基因
10、组学得以为肠癌筛查提供更丰富的线索,提高CtDNA的检测效率。mSEPT9是被报道最多的CRC特异性生物标志物，根据一项关于血液中SEPT9基因甲基化检测CRC性能的Meta分析显示，在有症状人群中，血液mSEPT9检测的效果优于血清蛋白标志物和Frr检测12。基于mSEPT9检测的试剂盒EpiproColon在2016年成为被FDA批准的首个用于CRC筛查的血液检验方法，亦被美国胃肠病学会结直肠癌筛查指南(2021)推荐为无创肠癌筛查技术之一7。目前，该试剂盒2.0版本的性能已在多项临床试验中被验证，灵敏度为71.1%95.6%,特异度为81.5%99.0%12基于相同原理，由中国研发的Se
11、nSiColorI试剂盒在中国人群中的灵敏度和特异度则分别达到76.6%和95.9%,且成本更低13o与粪便基因组检测一样，多靶点外周血DNA检测的研究被认为可进一步提高循环肿瘤DNA检测的诊断效能，多种甲基化基因的组合均被发掘出有用于肠癌筛查的潜力。基于联合检测SEPT9/SDC2的商业化产品ColoDefense试剂盒的诊断灵敏度达到88.9%,特异度达到92.8%14o部分联合甲基化模型甚至对肠道良性的腺瘤的检出也有良好的性能。一项回顾性研究使用甲基化特异性PCR建立了包含APC、MGMT、RASSF2A和WIF1甲基化的M评分模型，诊断I、II期CRC的灵敏度和特异度分别为86.5%和
12、92.1%,AUC为0.927,而对结直肠腺瘤的灵敏度和特异度分别为76.4%和91.3%,AUC为0.86415o另一项研究先通过焦磷酸测序分析健康结肠、腺瘤和CRC组织中选定CpG位点的甲基化，建立包含SFRP1、SFRP2、SDC2和PRlMAl基因的甲基化检测组合，不仅在CRC检测灵敏度和特异度分别达到91.5%和97.3%,也在肠道腺瘤方面诊断灵敏度和特异度分别达到89.2%和86.5%16o机器学习技术的引入使得CtDNA标志物的发掘有了强力的工具。中山大学附属第六医院利用高通量靶向DNA甲基化测序开发了一种新的基于11个甲基化生物标志物的CfDNA甲基化模型，诊断CRC灵敏度和特
13、异度分别达到83.9%和85.7%,AUC为0.91,该模型对I期CRC和晚期腺瘤均具有良好的诊断性能，AUC分别达到0.90和0.8517o中山大学肿瘤防治中心的团队应用机器学习算法建立的诊断模型AUC则达到0.96,并发现模型其中一个甲基化生物标志物cg10673833在CRC检测中优于其他先前报道的单个甲基化生物标志物，其灵敏度和特异度分别为89.7%和86.8%18o将机器学习算法应用到CtDNA片段长度分析19、核小体全基因组占用图谱分析20,可能会发现更多血浆中新的肿瘤特异性印记。在新一代测序技术的不断发展下，测序覆盖基因组的深度和广度不断进步,目前能分析更大部分甚至整个DNA甲基
14、化组的新技术已在研发中，可能会进一步增加DNA甲基化分析的敏感性,机器学习也将在其中发挥更大的作用。除此之外生物信息学分析在CtDNA甲基化靶点的筛选上具有一定应用。国内一项多中心病例对照研究中，研究人员利用原始测序数据，应用TrimmomaticxBWA-meth和Samblaster等生物信息学工具对序列进行比对和下游分析，生成含8090个甲基化块的区域甲基化值矩阵,构建的诊断模型灵敏度和特异度分别达到87.0%和90.1%,优于mSEPT9模型21。目前，已有多项大规模、多中心、前瞻性的队列研究正在进行中，以期提高CtDNA在CRC筛查上的证据等级，可能也会进入到指南所推荐的筛查策略中。
15、2.3 RNA标志物检测肿瘤中RNA的表达同样也存在异常，在血液和粪便中也能检出来自肿瘤细胞的异常RNA,成为诊断肿瘤的另一条线索。常见的RNA标志物包括mRNA和miRNA.IncRNA等非编码RNA,目前的研究主要集中在miRNA和InCRNA上。miR-21和miR-92a是较多被报道的标志物，前者诊断CRC的灵敏度为77.4%,特异度为84.6%22;后者的灵敏度为76%,特异度为64%23oInCRNA也可以作为诊断CRC的生物标志物。一项病例对照研究显示,全血NEAT1是CRC诊断和预后的一种新的InCRNA生物标志物,NEATLvI和NEATLV2两种变体诊断CRc的AUC分别为
16、0.787和0.871,灵敏度分别为69%和70%,特异度分别为79%和96%24o然而,对RNA标志物的研究目前大多停留在初步阶段，尚缺乏大样本、多中心的前瞻性临床试验，循证医学证据相对不足。03蛋白组检测技术肿瘤代谢组、蛋白组标志物是近年来的研究热点，但暂时还未发现有准确性较高的标志物可用于肠癌早筛。血清中的癌胚抗原（CEA）是第一种也是目前唯一一种被推荐用于CRC监测的外周血蛋白标志物，在监测CRC复发和转移方面有良好的效能，然而，CEA水平强烈依赖于癌症的分期，早期阳性率低，因而并不被推荐用于CRC的早期诊断25。蛋白质组学方法最近被应用在CRC患者的血液样本中，目前已经初见成效，一些
17、在早期CRC中有差异化表达的血浆蛋白标志物已被证实。一项利用了蛋白质谱分析和机器学习算法的研究中，找到了17种在CRC患者血液差异表达的蛋白质，利用其中8种蛋白建立的诊断模型AUC达到0.77,其中，诊断I11期CRC的AUC亦达到0.7226o然而,基于目前的技术下检测上述血清学标志物对CRC的准确性均偏低，暂时未能达到应用于肠癌筛查中的要求，尚需更多的研究和新技术的进展以提高蛋白组相关检测技术的诊断性能。04微生物组检测技术肠道微生态在CRC发生发展中的影响是一个新兴的研究热点，越来越多证据表明肠道菌群的失调在肿瘤微环境中发挥着重要的作用，与健康人体相比，各阶段CRC患者的肠道菌群的种类和
18、相对丰度均发生明显改变，肠癌患者的肠道微生物组存在其特征27。因此，应用qPCR、16SrRNA基因测序等技术对肠道微生物组的检测成为肠癌早期诊断的新策略，特别是基于二代测序技术的粪便宏基因组学，可以量化分析整个肠道微生物组,在CRC生物标志物的寻找上有很大的应用潜力。其中,具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum,Fn)与肠癌的关系尤为密切，粪便宏基因组和代谢组学研究显示Fn的相对丰度随结直肠肿瘤的进展显著升高28。一项Meta分析显示,利用Fn诊断CRC的灵敏度为71%,特异度为76%,AUC为0.80,但检出腺瘤的性能不佳,AUC仅为0.6029o联合检测Fn和其他微生物
19、组标记物能提高诊断性能。Fn与双歧杆菌(bifidobacterium,Bb)相对丰度的比例(Fn/Bb)在检测CRC时具有84.6%的高灵敏度和92.3%的特异度，AUC为0.911;而Fn/Bb和Fn与普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii,Fp)的比例(Fn/Fp)的组合则进一步提高了诊断价值，AUC达0.94330.除Fn以外，已经有数十种微生物标志物也被证实可用于肠癌的早期诊断，包括厌氧消化链球菌(Peptostreptococcusanaerobius)、微小微单胞菌(parvimonasmicra)等。研究者利用机器学习算法建立肠道微生物标志物诊断模型
20、，在更大的样本量中训练和测试，希望产生检出CRC性能更佳的诊断模型31此外，有研究使用血清样本，开发了基于8种肠道微生物组相关血清代谢物的检测通路，使其诊断灵敏度达83.5%、特异度达84.9%、AUC为0.92,显著优于CEA等血清标志物,对腺瘤和早期肠癌也显示出良好的诊断准确性，AUC分别为0.84和0.9332o肠道中的真菌和病毒同样受到关注，一种14种真菌的组合诊断肠癌的AUC达0.9333z而基于22种病毒分类群的检测能以0.802的AUC区分出肠癌患者与正常对照，与FIT联合后，其AUC能进一步提升至0.86234o虽然目前对肠道微生物组的研究热度较高，其在CRC早期诊断方面的潜力
21、已经被初步发掘，但已得出的结论仍相对较少，诊断的准确性和稳健性仍待进一步研究加以提高和证实。05其他CRC筛查新技术除了上述的粪便潜血试验、粪便或血基因组检测、蛋白组检测以及微生物组检测技术以外，目前还有许多具有CRC筛查应用前景的新技术逐渐被报道。外泌体(exosomes,Exo)是一种小的细胞外囊泡,大小在30150nmx主要与细胞间的通讯有关，来自肿瘤细胞的外泌体成为了新兴的液体活检研究对象，且由于有膜结构的保护，检测外泌体中的成分与检测血液游离成分相比可能更准确。最常用于诊断CRC的是对外泌体中miRNA的检测，miR-23asmiR-1246等多种外泌体miRNA均有良好的诊断性能3
22、5。一项研究建立了包含3种外泌体miRNA表达水平的诊断模型,对CRC的灵敏度和特异度分别达到95.06%和94.44%36o还有研究发现外泌体中蛋白标志物QS0X1的显著减少有助于CRC的检出,表明外泌体蛋白标志物可应用于CRC早筛检测37。高光谱成像技术(Kyperspectralimaging,HSI)是一种结合了图像信息与光谱数据的生物传感技术，首先在遥感技术中被广泛应用。由于其能挖掘出样品图像背后的、人工无法直接解释的大量理化特征信息，通过与机器学习算法相结合，近年来也被应用于肿瘤的诊断，已经有多项研究将高光谱技术应用到肿瘤活检组织切片的判读上，其中也包括CRC38如前所述，液体活检
23、是组织活检的良好替代方案，血清、血浆或血涂片中也蕴藏着组织切片中相同的信息，因而将HIS应用到血液标志物的分析，是一个有巨大潜力的研究方向。目前，已有初步的研究对血浆样品应用HSI技术和机器学习算法，在诊断其他实体肿瘤上取得了良好的准确性39。国内亦有基于无标签高光谱检测技术，扫描血涂片建立肺癌筛查的深度学习模型尚在研发中。血清或血浆表面增强拉曼散射(surface-enhancedRamanscattering,SERS)光谱检测技术也对多种肿瘤均有出色诊断性能，有小规模的初步研究发现SERS在诊断CRC方面有相当高的准确性40,但缺乏在更大样本量中的验证。人呼出的气体、粪便和尿液均具有特殊
24、气味，挥发性有机物(volatileorganiccompounds,VOC)是代谢组的挥发性部分，CRC患者的代谢组与健康人体是有差异的，因而对VOC的分析作为一种代谢组学方法也是很有前途的CRC筛查工具。随着电子鼻等技术的应用，许多初步研究证实了VOC在诊断CRC和结直肠腺瘤上具有一定的准确性41,气相色谱、质谱等技术的发展也将进一步推动VOC代谢组学诊断技术的深入研究。06结语与展望无创液体组织活检技术在CRC早筛的应用能极大提高社会筛查的效率和依从性，带来巨大的社会经济效益。FOBT.SDNA和CtDNA检测是最主流的无创筛查技术，由此衍生出的许多商业化试剂盒已逐步被推广使用。RNA、蛋白组、微生物组以及外泌体等检测的有效性也已被大量研究所证实，需要在多中心、前瞻性的研究中验证这些新技术筛查CRC的有效性和稳定性，提高其流行病学证据等级，使其早日得到临床应用与推广。无创液体组织活检技术运用于CRC筛查是一个有极其广阔前景、意义重大的研究方向，特别是在血液和粪便基因组、蛋白质组与微生物组方面的研究，尚待广大研究者进一步发掘。
