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1、肌集钙蛋白2与室性心律失常的研究进展2024摘要室性心律失常是一种常见的心律失常，是导致患者心原性猝死的重要原因。肌集钙蛋白2(Casq2)是CaSq家族中的一种，广泛存在于哺乳动物肌肉细胞内质网中。近年来，Casq2通过基因突变和翻译后异常修饰等方式在室性心律失常发生发展中的作用逐渐为人所知。该文主要综述Casq2的在室性心律失常发生中的作用及机制，为临床室性心律失常的治疗提供潜在新靶点。室性心律失常是一种严重危害人类生命健康的心律失常，常见的室性心律失常包括室性期前收缩、室性心动过速、心室扑动以及心室颤动。恶性室性心律失常可导致心原性猝死。目前，室性心律失常的治疗主要包括药物、除颤和导管消
2、融等，但均存在许多局限性和不足，因此，研究室性心律失常的发生机制并寻找新的治疗靶点具有重大意义口，2。大量研究证实肌浆网钙离子(Ca2+)稳态失衡是室性心律失常发生的重要原因3,4o肌浆网是心肌细胞内特化的滑面内质网，位于横小管之间，包绕在肌原纤维周围并交织成网，是细胞内Ca2+主要储存部位。肌集钙蛋白2(calsequestrin2,Casq2)是肌浆网内的Ca2+结合蛋白，具有储存并缓冲Ca2+的作用，此外,其还可调节兰尼碱受体2(Ryanodinereceptor2,RyR2)释放Ca2+进入细胞质，在心室肌细胞的兴奋收缩耦联中发挥重要作用5,6o本文主要综述Casq2的在室性心律失常发
3、生中的作用及机制，为临床室性心律失常的治疗提供潜在新靶点。一、Casq2的结构和功能1. Casq2的结构：Casq2是一种酸性糖蛋白，由399个氨基酸组成，哺乳动物中，CaSql和Casq2分别编码2种不同的CaSq亚型，不同亚型的Casq具有组织特异性，Casql仅在骨骼肌中表达，而Casq2可以同时存在于骨骼肌和心肌7,8。心肌中，Casq2可与RyR2、三体蛋白(triadin,Tr)和连接蛋白(junctin,Jnc)形成四元复合物锚定于肌质网管腔7oCasq2首次由CamPbeU等9从犬心肌组织中提取出来，其单体分子结构复杂，包含一个N.端、3个硫氧还蛋白样结构域以及一个C-尾端1
4、0,llo随着Ca2+浓度的升高，舒展的Casq2单体折叠成紧密的球体，由于存在大量酸性氨基酸残基，球体中心呈亲水性，可通过结合Ca2+稳定结构，同时发生构象变化，增加其与Ca2+的结合力。当Ca2+浓度进一步升高时，散在的单体发生聚合反应，聚合的Casq2可结合更多Ca2+。每个单体的N-端在各种哺乳动物中高度保守，其突变或缺失将导致Casq2无法正确折叠和聚合10。N-端还含有甘露糖组成的糖链，与Casq2单体在粗面内质网中的定位有关10,llo单个结构域内含有若干个B折叠和夹在其中的Q螺旋10oCasq2的C-端由酸性残基和间隔出现的非酸性残基组成，形成无规则的卷曲结构。大量酸性带负电的
5、天冬氨酸残基使C端成为Ca2+的主要结合位点，Ca2+浓度增高时,C末端结构可发生改变，由无序结构转变为螺旋结构。C-末端的螺旋结构还参与Casq2的四聚反应，使得Ca2+结合力进一步增强12。综上所述，Casq2单体的折叠和聚合可影响其Ca2+结合力，Casq2的N.末端和C-末端均在蛋白聚合中发挥重要作用。2. Casq2的功能：(1)储存并缓冲肌浆网中的Ca2+:Casq2的主要功能是储存并缓冲肌浆网中的Ca2+,使其保持在生理浓度。Casq2的聚合受肌浆网内Ca2+浓度影响，最初，单体Casq2通过N-末端面对面形成二聚体,在较高的Ca2+浓度下，二聚体的酸性C-末端尾部背靠背结合构成
6、四聚体，四聚体进一步聚合长链结构，聚合形态的Casq2形成额外的负电区域，可以结合更多Ca2+10,12-14oCasq2的磷酸化可改变C.末端的无序结构，增加其Ca2+结合能力，在浓度依赖性聚合中起到关键作用15。当肌浆网内Ca2+浓度在05L0mmolL范围内，Casq2以二聚体形式存在，在3mmol/L时可检测到四聚体群13。单体N末端或C末端的缺失均可导致分子不能形成丝状聚合物，Casq2聚合形态对于其在肌浆网上的定位十分重要，当发生突变时Casq2会从肌浆网上脱落口6。Casq2随Ca2+浓度增加发生聚合，聚合的Casq2可结合更多Ca2+,使心肌细胞收缩期肌浆网游离Ca2+浓度保持
7、在1mmol/L左右8,17,同时起到降低连接肌浆网渗透压的保护作用，但在缺乏Casq2的心肌细胞的肌浆网中的游离Ca2+快速消耗8o因此，Casq2对肌浆网内Ca2+具有缓冲作用。此外，研究发现，敲除Casq2后，心肌细胞肌浆网释放的Ca2+减少，而过表达Casq2导致肌浆网释放的Ca2+增多，在CaSql缺陷的骨骼肌细胞中也观察到类似的现象。因此，Casq2是重要的Ca2+储存蛋白。(2)调节RyR2释放Ca2+:Casq2除具有储存并缓冲肌浆网中Ca2+的功能外，还具有调节RyR2的Ca2+释放功能14o肌浆网是一种非常活跃的细胞器，参与钙的储备、释放和再摄取。肌浆网包括纵向肌浆网和终池
8、。纵向肌浆网通过肌浆网钙转运ATP酶(SarCO-endoplasmicreticulumcalciumtransportATPase,SERCA)从细胞质中重新摄取Ca2+o受磷蛋白是调节SERCA活性的关键酶之一，受磷蛋白与SERCA可逆地结合并抑制其活性，而磷酸化的受磷蛋白则与SERCA分离，抑制作用解除，SERCA恢复对Ca2+的亲和力和摄取能力。受磷蛋白过度表达或磷酸化减少均可导致心肌细胞内Ca2+紊乱6,18o终池则包括连接肌浆网和余下含钙泵蛋白的膜结构19,其中，连接肌浆网与T管相连，参与兴奋收缩偶联17,20oCa2+作为细胞第二信使，在细胞生理活动中发挥重要作用，受多种蛋白质
9、调控。RyR主要定位于哺乳动物细胞的肌浆网上，介导肌浆网Ca2+释放21o人类心肌组织中RyR主要有RyRhRyR2和RyR33种亚型，其中RyRl主要存在于骨骼肌细胞中，RyR2则在心肌细胞中显著表达，RyR3量少但普遍表达于各类组织细胞22。一方面，RyR2活性受磷酸化的影响，蛋白激酶A和Ca2+/钙调激醐11是参与其磷酸化的主要激酶。适当磷酸化可增强RyR2受体活性，维持细胞生理功能，而过度磷酸化则导致舒张期肌浆网Ca2+泄漏增加，Ca2+信号传导紊乱，进而导致心律失常和心力衰竭6,23o另一方面，Casq2可以直接作用于RyR2,抑制其活性，防止其自发性地释放Ca2+,当肌浆网Ca2+
10、浓度大于5mmol/L时Casq2与RyR2完全解离24,25oCasq2也可以通过Tr和JnC与RyR2形成复合物，Casq2的C-端与Tr和Jnc的KEKE序列结合，使其锚定在肌浆网膜上，4种蛋白相互结合，相互影响。肌浆网Ca2+浓度升高可削弱Casq2和该复合物其他成员之间的静电相互作用,Casq2从复合物上解离,不再抑制RyR2活性,RyR2开放概率增加，导致心肌细胞中肌浆网释放的Ca2+增加24,25,26o二、Casq2致室性心律失常Ca2+从肌浆网中循环释放和再摄取是兴奋收缩耦联以及心肌收缩和舒张的生理基础27o此外，心肌细胞内Ca2+水平还调节几种跨膜电流，影响细胞的动作电位。
11、因此，心肌细胞内钙稳态失调与心律失常的发生密切相关。而Casq2是重要的Ca2+调节蛋白，Casq2突变、翻译后修饰异常以及水平下调均会导致Ca2+稳态失衡，从而导致室性心律失常的发生13,14,28o1 .Casq2突变所致的室性心律失常：儿茶酚胺介导的多形性室性心动过速(Catecholaminergicpolymorphicventriculartachycardia,CPVT)是一种Casq2突变或RyR2突变所致遗传性疾病，情绪激动或运动时发生室性心律失常，机制为Casq2基因突变使RyR2过度激活，Tr和JnC表达下调。此外，肌浆网超微结构也有所改变，如肌浆网表面积增加，肌浆网中C
12、a2+自发释放增多，Na+-Ca2+交换体的活性增强，产生额外的钠离子内流和迟后除极，从而干扰正常心电活动，并导致折返形成。目前，CPVT中的Casq2基因突变已被广泛研究29,30,在所有CVPT病例中，Casq2突变占3%5%8,13o静息状态下，患者心电图通常无明显异常，而情绪激动或运动时心电图表现为双向或多形性室性心动过速,严重者转变为心室颤动29,31o目前，对于Casq2突变所致的CPVT患者，B受体阻滞剂是首选治疗方案，若B受体阻滞剂效果不佳，则可以联合其他药物如氟卡尼或普罗帕酮等32o以IC类药物氟卡尼为例，在CaSq2敲除的CPVT小鼠模型中，研究者发现，作为Na+通道阻滞剂
13、，氟卡尼可通过直接抑制RyR2介导的SR钙释放起到治疗CVPT的效果29,33o另外，也可置入埋藏式心脏复律除颤器或者左侧心脏交感神经去除术32o研究发现在Casq2结构域中，即使N末端或C-末端中单一的氨基酸发生变化也会导致Casq2的表达显著降低，这可能是因为突变蛋白降解增强所致34o而Casq2异常聚合会导致肌浆网内Ca2+的储备能力受损,影响RyR2与Casq2的结合从而干扰Ca2+诱导的钙释放7,35,36oCasq2第33位精氨酸（R33）残基位于N延伸臂末端与结构域I的第一个链之间，R33Q突变体可导致2个关键盐桥的破坏，无法形成正确定向的二聚体，使得Casq2在较高Ca2+浓度
14、下仍然表现出较低的Ca2+结合能力7,37,38o这种突变位于二聚体内的界面，而结构域In中第325位天冬氨酸被异亮氨酸替代（D325I）、结构域11中第180位赖氨酸被精氨酸替代（K180R）和第173位丝氨酸被异亮氨酸替代（S173I）时，则是在二聚体之间的界面破坏聚合。第173位丝氨酸（S173）残基与第325位天冬氨酸（D325）残基在负电口袋处占据一个关键位点，该位点加强了3种硫氧还蛋白结构域之间的相互作用。突变体S173I、D325I表现为多聚化率显著下降，长链结构形成障碍，而第325位天冬氨酸被谷氨酸替代（D325E）时也表现出聚合异常。此外，单体形成二聚体后，不同单体的结构域之
15、间形成盐桥以稳定结构，第180位赖氨酸（K180）残基在关键位点参与盐桥的形成，这对于稳定聚合物结构至关重要。但突变体K180R仅在镁存在时表现出丝状缺陷，且并非破坏盐桥，而是改变了附近阳离子结合位点的静电相互作用16,39o第251位精氨酸被组氨酸替代（R251H）和第308位脯氨酸被亮氨酸替代（P308L）时，结构分析表明它们可能干扰二聚体的堆积，导致构象松散不能进行稳固的丝状化，功能失调的聚合物可能保留在肌浆网内，随后扰乱正常的钙诱导的Casq2细丝形成38,39。在心肌细胞中,这些改变均导致不同程度的肌浆网Ca2+负荷减少和RyR2自发开放增加，这也提示相同的室性心律失常表型可能是由不
16、同的Casq2基因突变导致的，而不同位点的突变所致室性心律失常的严重程度可能并不相同，更多基因突变还有待证实。2 .Casq2蛋白翻译后修饰所致的室性心律失常：翻译后修饰包括糖基化和磷酸化,影响Casq2定位和功能,与室性心律失常的发生密切相关口4。CaSq2在粗面内质网上合成，以单体形式沿管腔顺行运输，并以聚合物形式集中在连接肌浆网腔内40oCasq2合成后，蛋白的N-末端甘露糖含量较高，在随后的运输中被细胞内的甘露糖昔酶剪切修饰口口，而在生理状态下Casq2的糖基链一般由6个甘露糖残基组成，异常糖基化将会影响Casq2正确定位和聚合15。刚合成的Casq单体位于粗面内质网起始部位，通常有较
17、高的磷酸化水平，向连接肌浆网转移的过程中Casq2逐渐去磷酸化11。SanCheZ等15发现人类Casq2主要磷酸化位点是第385和393位丝氨酸，这两个位点的磷酸化会产生C.末端的无序结构到有序结构的转变，并增加其Ca2+结合能力。因此，Casq2磷酸化具有潜在调节钙依赖性聚合的能力。Casq2的甘露糖含量过高以及过度磷酸化均可增加其在粗面内质网中滞留H,13o连接肌浆网与心肌细胞核膜相连，而粗面内质网作为核周池存在于心肌细胞中41。Casq2在核周粗面内质网中的积累可能在局部Ca2+稳态的调节中发挥作用，这可能导致病理生理反应。心肌收缩由钙诱导和钙释放触发，从RyR2释放的Ca2+被可视化
18、为钙火花。钙火花放大了初始的Ca2+内流触发信号，并结合在一起产生了全细胞Ca2+浓度的升高，称为钙瞬变42。心力衰竭时，Casq2的甘露糖含量过高且过度磷酸化11,13,导致心室肌细胞核周池中Casq2的滞留并增强Ca2+瞬变，间接促进Ca2+依赖性转录和心室肌细胞肥大，诱导自发性心律失常的Ca2+瞬变从核周区域而不是连接肌浆网发出41o3 .其他Casq2下调所致的室性心律失常:线粒体功能障碍可下调Casq2,但其具体机制仍未明确。氧化应激损伤导致的线粒体功能障碍是心律失常发生的基础，线粒体解偶联剂可增加线粒体活性氧的生成，用线粒体解偶联剂处理体外培养的小鼠心室肌细胞48h后，可发现Cas
19、q2的表达随解偶联剂浓度的升高而降低，同时肌浆网内的钙缓冲作用减弱，肌浆网内总的Ca2+含量减少，释放的Ca2+增多，钙瞬变的幅度和持续时间也显著下降。而加入活性氧清除剂，可逆转上述表现13,43o甲状腺功能亢进是一种已知的致心律失常疾病，在甲状腺功能亢进大鼠分离的左心室心肌细胞中检测到Casq2表达减少44,可能是由于Casq2抗体的存在所致45,CaSq2表达的减少促进RyR2的功能，导致舒张期Ca2+渗漏，钙火花振幅增加和异常钙火花发生率升高，并且在没有肌浆网Ca2+过载的情况下产生异常钙火花，在心电图中表现为室性期前收缩和心动过速44o心肌缺血再灌注损伤可导致心肌细胞缺氧，造成胞质内钠
20、超载、钙超载，心律失常的易感性增加。ChoU等46采用db/db小鼠建立糖尿病小鼠缺血再灌注模型，发现Casq2在心肌细胞中表达下调，进而增加了肌浆网RyR2介导的Ca2+泄漏。同时SERCA受损导致肌浆网摄取Ca2+能力减弱，而增加的晚钠电流亦可激活Ca2+/钙调激酶11,进一步增加肌浆网Ca2+泄露。三、Casq2可能是室性心律失常的潜在治疗靶点腺病毒转染野生Casq2基因至Casq2基因突变所致的CPVT患者的人诱导多能干细胞分化的心肌细胞后，迟后除极的发生明显减少，钙火花的密度和持续时间恢复正常，提示基因治疗可用于Casq2基因突变所致的CPVT47O最近有研究表明，腺病毒转染Casq
21、2基因可改善Casq2R33Q小鼠的CPVT表型48,49oDenegri等34在Casq2基因敲除小鼠出生时经腹腔注射携带Casq2基因的腺病毒载体血清9型，20周龄时心肌细胞内CaSq2、Tr和Jnc表达恢复到正常的水平且定位正确，连接肌浆网形态正常，并未出现转染后Casq2过表达、Tr/Jnc生理比例失调，以及以连接肌浆网肿胀为特征的“毒性”效应。小鼠室性心律失常发生率降低，心率恢复正常。此外，在Casq2D307H小鼠模型中，携带Casq2基因的腺病毒载体血清9型同样显示出改善和潜在治愈CPVT的能力，表现为当正常Casq2水平超过心肌总体Casq2水平的33%时即可预防非持续性室性心
22、动过速以及应激引起的室性早搏50o1.167HD307HP308L和R33Q等基因突变会影响Ca2+诱导的Casq2聚合，损害RyR2介导的Ca2+在心肌收缩-舒张中的释放，从而导致心原性猝死。研究发现，多种小分子化合物可与Casq2结合并影响其功能。如阿霉素与Casq2结合后影响其聚合能力，并且有较明显的心脏毒性51o目前ChakraVarty等51首次合成可与Casq2结合，且不产生氧化应激反应、不干扰RyR2的毗喃酮类似物，利用乙二醇四乙酸介导的再溶解/解聚，评估其调节Casq2的能力。毗喃酮类似物在乙二醇四乙酸低于10molL的浓度下抑制50%以上Casq2的解聚被认为是有活性的，在1
23、00nmol/L时能够抑制50%以上Casq2解聚的分子被认为具有高活性。研究表明，在毗喃酮环的C-6位置含有4-氟苯基基团和在C-4含有开伯胺的化合物是同类化合物中活性最高的，叱喃酮类似物是具有稳定Casq2聚合能力的有潜力的化学药物，为使用小分子药物调节CASQ2聚合靶向解决Ca2+释放障碍提供了新思路。因此，通过小分子药物靶向调节Casq2聚合可能是治疗CPVT和其他室性心律失常的新途径。雷诺嗪可治疗Casq2下调导致的室性心律失常。对于其他继发的室性心律失常仍是以抗心律失常药物和手术治疗为主，积极控制和治疗原发病可降低室性心律失常的发生率，目前尚未发现明确的以Casq2为靶向的治疗药物
24、。此外,Casq2在器质性心脏病的发生中也起重要作用。有研究表明，Casq2的单核甘酸多态性与冠心病和心力衰竭发生相关52,Casq2第63位天冬氨酸被谷氨酸取代（D63E）将导致肥厚性心肌病53,由此可见Casq异常可能是心原性猝死的危险因素，基因筛查可提前发现病因并制定相应的治疗方案。综上所述，Casq2具有储存和缓冲肌浆网内Ca2+的作用，并通过调节RyR2参与心肌细胞Ca2+释放,在维持细胞内Ca2+稳态方面发挥关键作用，而Casq2功能缺失会导致肌浆网重塑和室性心律失常发生的易感性增加。目前基于Casq2基因治疗和小分子药物靶向治疗已取得明显疗效，提示Casq2可能是室性心律失常治疗的潜在新靶点，但其在临床中应用和推广仍需进一步研究。
