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1、激光显微内镜在结直肠疾病中的应用进展2024摘要：共聚焦激光显微内镜作为一种新兴的内镜技术，可以对体内组织进行实时虚拟活检，从而获得高质量和高分辨率的组织图像。大量研究表明共聚焦激光显微内镜在结直肠疾病的靶向诊断、严重程度评估、个体化治疗及预测预后等方面具有重要价值。就这项新技术目前在结直肠疾病中的应用价值及未来的发展方向进行综述。传统内镜是目前诊断结直肠疾病的一种常规手段。伴随着技术的发展与进步，出现了诸如放大内镜、色素内镜等新技术，使得诊断结果更加精确，但是这些技术在进行组织学诊断时，仍必须对病变部位进行活检，不仅增加了操作成本，还有出血、穿孔等风险，而共聚焦激光显微内镜(confocal
2、laserendomicroscopy,CLE)的出现刚好可以弥补这个缺陷。CLE作为新兴的内镜技术，自2004年推出以来，已经实现1000倍放大和1m分辨率的成像1z具备实时活体组织学评估能力，可以在持续的内镜检查中对病变部位的血管、结缔组织及细胞或亚细胞结构的变化进行实时监测2,即虚拟活检。本文将概述CLE在当前结直肠疾病中的应用价值及未来的发展方向。一、工作原理CLE是在基于共聚焦显微镜的基础上，使用低功率激光照射在一个已确定的组织平面上，然后光电检测器检测到通过针孔聚焦的组织荧光，由计算机系统转化为电子图像，最后形成一个灰度图像，代表着某一个特定的平面。目前CLE分为两种类型：基于内镜
3、的CLE(endoscope-basedCLE,eCLE)和基于探针的CLE(probe-basedCLE,pCLE)3o在eCLE中,CLE集成在内镜的前端40而在pCLE中,CLE探针需通过传统内镜的活检孔道。目前用于pCLE的探针类型有:GastroFIex,ConoIFIex,ChoIangioFIex,AQ-FIex19以及CeIioFIex5,6O不论是eCLE还是PCLE,要想获得高质量、高分辨率的共聚焦图像，外源性对比剂如荧光素钠、期嚏黄以及甲酰紫等具有重要作用。目前临床上应用较为广泛的是荧光素钠和盐酸口Y咤黄。局部外用口丫咤黄可以强烈标识包括细胞核及细胞膜在内的浅表黏膜上皮细
4、胞而显像，但口YD定黄可能存在致癌风险，这在一定程度上限制了它的临床使用价值。静脉注射荧光素钠后,进入血液中的一部分荧光素可与白蛋白结合，其余未结合的荧光素进入组织后强烈标记细胞外基质而显像70二、在结直肠疾病中的应用1 .炎症性肠病(inflammatoryboweldiseasezIBD):IBD是一种由多种复杂因素相互作用导致的肠道慢性炎症性疾病，主要分为溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)和克罗恩病(crohndisease,CD)两种亚型8o在正常的肠黏膜中,由于上皮细胞排列紧密，荧光剂无法通过这层完整的屏障而在IBD中,上皮细胞由于炎症活动导致其完整性受到破坏，
5、荧光剂得以渗漏进组织而显像。CLE镜下IBD的炎性特征包括隐窝形状不规则、上皮细胞间隙增大、荧光素渗漏等表现1oQUmn6herv省等9利用CLE对50例IBD患者以及9例对照组患者的14项形态学及功能学改变进行评估,设计出一种基于计算机的CLE图像分析方法来诊断IBD以及区分UC和CD,其中诊断IBD的敏感度和特异度均为100%,鉴别UC与CD的敏感度、特异度分别为92.3%和91.3%。后续的一项研究进一步证实了CLE能够可靠地区分正常及炎症性肠黏膜,并可以作为IBD诊断的辅助手段10o上皮内瘤变和癌变是IBD严重的远期并发症，最近一项纳入9项研究的meta分析表明，CLE可以准确识别IB
6、D患者肠黏膜肿瘤性与非肿瘤性病变，敏感度为91%,特异度为97%110在另一项研究中，DePlama等12利用荧光素偶联的VRPMPLQ肽作为分子探针,从9例UC患者中切除了11处内镜下疑似异型增生的病变，用肽喷洒标本并进行CLE检查，然后将图像与相应的组织学切片进行比较，发现VRPMPLQ肽对结肠异型增生组织具有良好的亲和力，证实了CLE联合靶向荧光标记肽在检测UC相关的异型增生病灶方面具有一定的可行性。准确评估IBD炎症活动度，有利于评估病情、制定方案、预测预后。一部分研究表明，CLE在评估IBD炎症活动度方面具有较高准确率，并建立了基于CLE的评分标准，包括：以隐窝改变、血管增生、固有层
7、细胞浸润、杯状细胞数量改变、微侵蚀等为基础的CD内镜下活动评分13;以小肠及微侵蚀腔荧光素渗漏等为基础的Watson量表14,15;以血管直径20mx隐窝结构不规则、隐窝腔扩张及荧光素渗漏为评分基础的ENHANCE指数16;以及Ll等17提出的以隐窝排列、隐窝密度、隐窝开口变化等为基础的评分量表。这些评分标准能在一定程度上可靠地评估肠黏膜炎症活动程度。肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactorzTNF)抗体通过与跨膜型肿瘤坏死因子(membrane-boundtumornecrosisfactorzmTNF)结合可以抑制CD的炎症反应。在一项临床试验中,Atreya等18利用CLE评
8、估了25例接受TNF抗体治疗的CD患者治疗反应J2周后发现与mTNF细胞数量少的患者相比,具有大量mTNF免疫细胞的患者对治疗的反应率要高得多(92%比15%,P0.001);此外，还发现mTNF高表达的患者对治疗反应持续较长时间，并且与后续内镜随访检查时的黏膜愈合有关。Iacucci等19以类似的方式利用CLE对29例接受生物治疗的IBD患者的治疗反应进行评估，发现结肠黏膜荧光素渗漏和隐窝间距是监测UC患者治疗反应良好的指标,而血管迂曲度、隐窝面积及隐窝间距是监测CD患者治疗反应良好的指标。以上结果表明，CLE在预测生物制剂治疗IBD的疗效方面具有重要作用，同时可以指导IBD及其他慢性炎症性
9、疾病药物的合理选择及个体化治疗。黏膜愈合与IBD持续的临床缓解以及较低住院率相关,是目前IBD治疗的关键目标。在一项前瞻性研究中，Hundorfean等20建立了一个基于CLE的UC内镜下黏膜愈合评分(endomicroscopicmucosalhealingscorezeMHs）来评估UC患者接受治疗后微观黏膜的变化,评分标准包括隐窝数量变化、隐窝扭曲/畸形、隐窝腔及周围血管渗漏研究发现eMHs在评估黏膜愈合方面具有较高的敏感度（100%特异度（93.75%）和准确率（94.44%）;此外，eMHs还与组织学评分（Gupta指数）以及内镜活动评分（Mayo评分）有良好的相关性。在另一项利用p
10、CLE评估分析UC缓解期微循环改变的试验中，研究者建立了周围型、蛛网型和缺乏型3种黏膜毛细血管血流模式，发现黏膜局部缺血现象与UC缓解期的黏膜愈合不完全以及复发率增大有关，微循环指标，特别是这三种黏膜血流形式，可作为进一步研究黏膜愈合的指标21LIBD的复发是目前疾病诊疗关注的热点，Kiesslich等15使用CLE来评估IBD患者局部屏障功能障碍和复发之间的关系他们发现IBD患者小肠上皮间隙增加和荧光素渗漏与较高的复发率相关，敏感度为62.5%,特异度为91.2%,准确率为79%。随后一项类似的研究显示,CLE在预测IBD复发方面的敏感度、特异度和准确率分别为64%、88.9%和74.4%2
11、2,与Kiesslich等15的研究结论相当。后续一些文献研究进一步证明CLE在预测IBD复发方面具有重要意义23,24,25o2 .结直肠息肉：结直肠癌主要来源于恶变倾向息肉（腺瘤和锯齿状病变）6o早期鉴别恶变倾向息肉，可以有效预防息肉癌变。因此，在基于pCLE（迈阿密分类）和eCLE（美因茨分类）基础上建立了结直肠息肉的CLE分类系宽26z27o腺瘤性息肉在PeLE镜下可见多种异常结构特征,包括不规则绒毛状结构、上皮颜色变深伴不规则增厚以及杯状细胞减少等表现26o最近一项研究还确定了CLE镜下无蒂锯齿状腺瘤/息肉的主要特征：薄雾状外形的黏液帽；细长的、分支的隐窝；黏蛋白增加，表现为杯状细胞
12、及含微泡黏蛋白细胞数量增加；结构紊乱，表现为隐窝结构变形(主要表现为隐窝底部扩张，分支或水平延伸)和营养不良性杯状细胞的存在281CLE在区分结直肠恶变倾向息肉方面具有重要价值。最近一项研究利用PCLE来区分增生性息肉与管状腺瘤，发现与增生性息肉相比，管状腺瘤黏膜结构改变很明显，具体表现为腺体外观呈绒毛状、上皮颜色变深伴不规则形态改变以及杯状细胞数量减少29oTaunk等30发现CLE联合计算机辅助诊断技术(computer-aideddiagnosis,CAD)可获得高度准确的息肉组织学结果(敏感度为95%特异度为94%准确率为94%),如果使用CAD算法来辅助初级内镜医师,则他们的表现可以
13、提升至专家水平，能够更为高效、准确地诊断结直肠息肉病。除此之外，CLE在评估结直肠息肉病变边缘、浸润深度等方面也具有极大的潜力31,32l33o.结直肠癌：一项研究用CLE联合荧光标记的脂肪酸(BODIPY-Fa)来进行早期结直肠癌的诊断，结果显示非肿瘤组织的BODIPY-Fa强度分别比低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变和肿瘤组织高出近1.6倍、2倍和2.2倍,提示相较于非肿瘤组织，肿瘤组织对BODIPY-Fa摄取减少；研究还发现，与静脉应用荧光素钠相比，BODIPY-Fa染色联合CLE具有更高的一致性（0.68比0.43）和总体有效性（74.65%比55.88%）340Wang等35利用类似
14、方法评估CLE联合荧光标记的荆豆凝集素（ulexeuropaeusagglutinin,UEA）-异硫氨酸酯荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FrrC）诊断结直肠癌的可行性,CLE镜下可见UEA-FITC在结直肠癌组织中的荧光强度明显低于正常组织，研究显示相较于单独使用CLE（敏感度为81%91.4%,特异度为76%85.7%）36,37zUEA-Frrc联合CLE对结直肠癌显示出更为良好的诊断准确性（敏感度为95.6%,特异度为97.7%I这表明CLE联合分子成像技术在结直肠癌的诊断方面具有极大的潜力。1.iU等38在2018年提出利用CLE评估低位直肠癌病变部位远
15、端切缘性质。该研究前瞻性纳入18例低位直肠癌患者，其中11例病变直肠远端切缘黏膜结构和细胞形态正常，评估为切缘阴性,其余7例病变直肠远端切缘黏膜结构和细胞形态异常，评估为切缘阳性，最后依据切缘性质确定低位直肠癌的手术方式，其敏感度为85.71%,特异度为100%,准确率为94.44%另一项研究通过CLE来评估结直肠癌病变的浸润深度,研究发现隐窝结构缺失代表癌变浸润深度位于黏膜下深层或更深，基于这一发现，研究者提出了一种简单的pCLE分类来诊断结直肠癌的浸润深度，实时评估的敏感度、特异度和准确率分别为100%、94%和95%31o以上结果表明，CLE有助于评估结直肠癌的病变边缘和浸润深度，因此有
16、利于选择使患者受益最大化的治疗方案。新辅助放化疗加根治性手术是目前晚期直肠腺癌最佳的治疗方法，然而，临床完全缓解的患者可以进行密切随访而不需要立即手术39,40z41,42,430最近有学者利用pCLE评估晚期直肠腺癌患者在接受新辅助放化疗后的反应，研究纳入47例患者，在基于pCLE的基础上建立了一个通过评估病变部位上皮和血管特征来区分临床完全缓解患者和残余瘤变患者的评分系统，结果显示PCLE诊断临床完全缓解的敏感度和准确率均较高(分别为100%和95.7%)440这有助于确定哪些晚期直肠癌患者可以进行密切随访，避免立即手术治疗，从而提高患者的生活质量。3 .肠易激综合征(irritableb
17、owelsyndrome,IBS):在传统内镜下难以观察到IBS存在炎症性改变,所以IBS常被认为是一种功能性而非结构性改变的疾病。但最近有研究表明,利用pCLE可以监测IBS患者肠黏膜微炎症的存在JBS患者在CLE镜下表现为隐窝腔荧光素渗漏伴细胞浸润、隐窝形态分布不规则、隐窝间距增大以及轻中度毛细血管数量增加；研究还发现，相较于健康志愿者JBS患者结直肠黏膜炎症发生率升高450这表明CLE可能是评估IBS患者肠黏膜微炎症的可靠方法。Fritscher-Ravens等46利用CLE实时显示疑似食物不耐受的IBS患者在接受食物刺激后肠黏膜的结构/功能变化,发现约60%的IBS患者，当他们的十二指
18、肠黏膜暴露于特定食物成分时，会产生非常迅速的炎症反应，具体表现为肠黏膜破损、上皮间隙形成、绒毛间隙增宽和上皮内淋巴细胞增加。这些发现在最近一项更大规模的研究中得到了重复和拓展47,这表明CLE可以对特定食物成分引起的IBS患者肠黏膜结构/功能改变进行可视化诊断，是一个非常有价值的诊断工具，并可以指导IBS患者后续的治疗方案。Turcotte等48利用pCLE来比较IBS患者和健康对照组肠上皮间隙密度之间的差异，发现IBS患者肠黏膜上皮间隙密度高于健康对照组,这表明肠黏膜上皮间隙密度升高可能是IBS屏障功能障碍和黏膜炎症的潜在机制；研究还发现，对照组中女性肠黏膜上皮间隙密度比男性的高，这一发现为
19、女性更易患IBS提供了一个可能的解释。三、总结CLE作为一项新兴的内镜检查技术，具备活体组织学评估的能力，可以实时获得高质量以及高分辨率的结直肠图像，在当前结直肠疾病的诊断、鉴别、治疗及评估远期预后等方面具有极大的潜力。未来随着荧光标记抗体、多肽等新型分子探针的不断出现以及相关人工智能技术的逐渐成熟，CLE在结直肠疾病靶向诊断、个体化治疗及预测治疗反应等方面的重要性将越来越凸显。但目前CLE的应用仍存在一定的局限性:(1)由于目前大多数CLE研究是由资深的内镜专家而非普通内镜医师来进行的，因此这些研究所得的数据及结论能否得到推广还有待进一步研究证明；(2)与传统的内镜技术相比，进行CLE的内镜医师需要对结直肠的微观结构有一定的掌握,这对大部分内镜医师来说是一个不小的挑战；(3)就目前来说CLE设备的成本较高,如果想要普及这项技术,那么其较高的检查成本不容忽视X4)CLE可能不适用于对造影剂过敏的人群，因为CLE较为严重的不良事件主要与造影剂的过敏特性有关49,因此未来还需要对有过敏史的患者进行更多的安全性研究。综上所述，虽然目前CLE仍存在一定局限性，但随着技术的发展与创新，未来CLE技术将会愈来愈成熟，并在结直肠疾病的诊疗中发挥愈来愈重要的作用。
