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1、摘要：与其他哺乳动物相比，斑马鱼具有繁殖能力强、繁殖量大、生命周期短、养殖费用低、身体透明等特点。主要从心血管毒性、肝脏毒性、肾脏毒性、神经毒性、脾脏毒性和急性毒性6个方面进行归纳总结，结果发现斑马鱼的多个器官在形态、基因表达及生理特性方面均与哺乳动物高度相似，已被广泛应用于药物的毒性物质筛选研究。药物对斑马鱼毒性研究主要集中在死亡率和畸形率增加，心、肝、肾、脾等脏器形态、表型改变并伴有水肿及神经毒性等方面；其毒性机制主要涉及影响器官中细胞凋亡（p53通路）、炎症（NF-KB通路、白介素）或影响该器官功能蛋白、酶或mRNA,如丙氨酸氨基转移酶（A1.T）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乙酰胆碱
2、酯酶（AChE）,微球蛋白前体（mbp）和微管蛋白（tubulin）等。斑马鱼模型可作为一种评估药物安全性与毒性最为高效、快速、便捷的方法，阐明药物的毒性作用及其多组分多靶点的毒性作用机制，可为药物毒理学中的毒性评估提供新的思路。斑马鱼俗称为斑马担尼鱼、蓝条鱼、印度鱼，是一种原产于印度和孟加拉国的辐鳍亚纲鲤科热带硬骨鱼，身上有数条可直达尾鳍的深蓝色条纹，因其全身条纹形似斑马纹而得名。斑马鱼是仅次于小鼠的第2大模型生物，其具有体积小，样本量大，胚胎透明易于观察，与人类基因同源性高和实验周期短等优势1-3,其胚胎、幼鱼和成鱼最早是被用来检测水中的有毒物质和致畸物4。后来也用于环境污染物的毒性评价，
3、如原油、农药、重金属、工厂污水和消毒副产物等对生态环境的毒性损害5-7。StreiSinger等于1981年首次将斑马鱼与遗传学和生物学领域划上联系，使其研究领域得以拓展和延伸。目前，斑马鱼已被广泛用于遗传学、生态毒理学、药物药效活性物质筛选、药物代谢、药物毒性物质筛选等方面9-11。斑马鱼在药物毒理学评估中的应用汇总如图1所示。XE马鱼箱bs*3I3IIfc二SMMS；i版II亡I充;.2IT1毒性作用及机制研究工因分机(qPCR)-H分析(Ueaemblomng)代分析(MFA)画何毒性作用及多坦分多Ie点作用机制图1黄马鱼在药物蠹理学评估中的应用F.1ApplkarionofZebraf
4、iSIIindingtoxicologyassessment提高药物早期毒性预测的可靠性和灵敏度已成为新药开发行业的迫切需求，而斑马鱼具有高通量的评价、检测和筛选药物毒性作用的独特优势，其作为药物毒性与安全性评价的实验动物受到医药学界越来越多的重视，已逐渐成为药物研发过程中毒性评价和安全性评价的重要工具12。结合国内外文献报道，本文综述了斑马鱼作为新兴模式生物在药物毒理学评价方面的研究进展，主要从药物心血管毒性、肝脏毒性、肾脏毒性、神经毒性、脾脏毒性和急性毒性6个方面及多组分多靶点的毒性作用机制进行归纳总结，以期为斑马鱼在药物毒理学中的毒性评估提供新的思路。1评估药物的心血管毒性1.1 斑马鱼
5、评价心血管毒性的优势心血管毒性是药物研发的主要限制因素口引。斑马鱼的心血管系统是由心房、心室、静脉窦和动脉球串联而成14,其心脏发育是一个迅速但复杂的过程,胚胎在受精后5h(hourspostfertilization,hpf)时心脏前体细胞成型,22hpf时心脏开始出现收缩动作，48hpf时功能性瓣膜逐渐形成，心率趋于稳定，72hpf时完成胚胎期心脏的发育。与此同时.，斑马鱼在24hpf时尾部由蜷缩状态开始伸展，节间血管开始生长，到48hpf时节间血管基本发育完全。有研究报道，斑马鱼心脏发育的形态、基因、生理特性以及血管生成过程均与哺乳动物相似15-16,可通过光学显微镜对其心脏、血管和血液
6、流动状态进行全程的监视，用于探究药物对斑马鱼的心血管毒性作用，为筛选药物的心血管毒性作用提供有效依据17。目前，在血管系统、血液、内皮细胞和心脏中表达荧光蛋白的转基因系斑马鱼的可用性也有助于精确和准确地评价药物对心血管系统的影响18。可见斑马鱼的上述优势使其成为筛选药物心血管毒性的重要生物模型。1.2 药物对心血管毒性的影响传统中药中提取分离出的很多单体化合物具有明显的药理活性，可以作为新药研发过程中的先导化合物，但是由于它们可能具有一些潜在的心血管毒性作用而限制了其临床应用。何俊霖等19以2、4、8、10gm1.异甘草素处理正常斑马鱼胚胎10、24h,结果显示异甘草素质量浓度高于2gm1.可
7、抑制斑马鱼胚胎血管生成，达8gm1.时，胚胎开始出现轻微血液瘀滞现象，且完全抑制尾部静脉血管的生成。异甘草素处理12h后，胚胎心率随异甘草素质量浓度的升高而呈降低的趋势，当质量浓度达到10gm1.时，对胚胎心率有持续性的抑制作用和诱发心脏畸形的作用，导致胚胎心包和卵黄囊肿大。这表明高剂量的异廿草素对斑马鱼的胚胎发育有较强的毒性作用。赵慧等20建立阿霉素诱导的转基因Tg(cmlc2:EGFP)系心脏特异表达绿色荧光斑马鱼心肌损伤模型，结果显示阿霉素30、40gm1.干预24、48h后，胚胎生存率显著降低，其活动受到抑制，心房、心室变大，出现不同程度的心包水肿，且动脉球间距显著增大；病理染色结果也
8、提示给药后斑马鱼心脏明显变大，且结构紊乱，有红细胞溢出等。此外，氯化铁、广蕾香、诺氟沙星、京大戟等对斑马鱼心血管发育生长也具有一定影响121-27o斑马鱼在药物心血管毒性中的研究见表1。表1斑马鱼在药物心血管毒性研究中的应用TaMe1AppbcarionofZebnIfhhinSnIdyofdrugcardk)vascuhrtoxkin利马鱼基因型bf给药时间b检测指标实验结论理斤甘草素Tg(JDrl：GFP)1012-48畸形率：存活率：胚胎血管生6、8咫血】异甘草素具有良好的抗I1.成：厩胎心率：心脏形态管生成和减慢心书的作用.I0gm1.T具有一定的考性19Tg(Ek2：EGFP)362
9、4-48生存率：动肽球间距：HE染同露素时理马鱼胚脂的心肌畏伤作用色：DAPffirlUNE1.染色呈时间和浓度相关性,其机制可健与增加心肌细总碑亡有关20京大粮AB品系1260心脏形态：胚胎心率：动味球京大财趣马鱼胚胎具行心脏有性,但悯距：心脏细也再亡M制后能减镀对心肌组Ift的描伤.从而降曼其心股毒性21氯化假Tg(Cwk：GFP)666死亡率I胚胎心率：心脏形态I2、4molU氯化馔对理马鱼心脏有件动脓球向距找为明S22多肽Ml1.ARS1.KTMTtma品系0.7536-72胚胎心率：心包发角情况：G多肽3M1.ARS1.KT刈可能影响逆马鱼胚脏形态:Mvrnhc、MR胎阚心脏的发育及
10、雁和血25基因的表达23诺氟沙星AB品系66-90死亡率：脊柱弯蓟；心包囊肿：诺氟沙星对药马鱼胚胎的发。具有数卵黄囊肿：TGF-l基因的崎和致死作用故24广香油及其主要成分AB品系1024-961.D：死亡率：存活承；瞄影广油及其主要成分对理马他胚胎*：斑胎形态：脊柱弯曲；发育均有心胺毒件寺性大小：广报尾次数：胚胎心率在丽广，香静广青春泊25紫草素Tg(.AW：GFPKAB品系0、10、24、4812T1.D：畸形率：死亡率：胚胎紫甲素对司马鱼胚胎发自具有*性.并心率：胚胎如管生或对其血管生成有一定的抑制作用26木番挥发泊AB品系2、12、24361.D：崎形率：胚龄心率；心木香挥发油对国马鱼
11、胚饴发育有一定脏腕的毒性,而且发育期越早，对其心脏毒性超大273l书化生K因子干1S半数致死，TGFflt1111fc11mnggrowthaClorfl1.D50*medumlethaldose1.3 药物对斑马鱼心血管毒性的作用机制赵慧等20通过阿霉素建立心肌损伤模型，通过DAPI和TUNE1.染色发现阿霉素40gm1.组斑马鱼心脏明显变大，细胞数目减少且较稀疏，细胞核增大,凋亡细胞增多，且阿霉素对斑马鱼胚胎的心肌损伤作用呈时间和浓度相关性。表明阿霉素诱导的斑马鱼心肌损伤模型是可靠的，且其机制可能与增加心肌细胞凋亡有关。王冬梅等24观察了0、10、20、40mol1.诺氟沙星对斑马鱼胚胎不
12、同发育时期脊柱弯曲、心包囊肿、卵黄囊肿和死亡率等毒性作用，结果显示随着诺氟沙星暴露浓度的增大，胚胎的发育延迟，孵化时间延长，胚胎死亡率增加；且暴露于不同浓度诺氟沙星的斑马鱼胚胎中TGF-l基因表达随发育时间延长而增加趋势减缓。提示诺氟沙星的心脏毒性机制与TGF-Pl基因相关。2评估药物的肝脏毒性2.1 斑马鱼评估肝脏毒性的优势药物性肝损伤已逐渐变成临床医学和新药研发中的一个重大挑战。因此，寻找新的模型来预测潜在治疗药物是否导致药物性肝损伤迫在眉睫。研究表明，斑马鱼肝脏在28hpf时开始发芽，在72hpf时被血液灌流并具有生理功能，在肝脏的形成过程中，其通体透明，易于观察28-30。有研究显示，
13、斑马鱼的器官、生长因子和基因的表达、肝细胞组成、功能、信号和对损伤的反应等方面与高等脊椎动物有很多相似之处31-32,使其成为检测药物肝毒性和研究其肝毒性机制的重要手段。将胚胎或幼鱼暴露，通过观察肝脏表型、特殊染色处理或生化指标检测等手段，可直接或间接探究药物对斑马鱼肝脏的影响。此外，采用肝脏荧光转基因斑马鱼，如Tg(fabpl:EGFP)、Tg(zlyz:EGFP)等作为模型，是评价肝脏毒性的又一手段，通过斑马鱼整体图像的分析技术，对肝脏面积大小和肝脏荧光强度进行综合定量分析，快速、系统的评价药物的肝脏毒性作用33。因此,斑马鱼作为药物肝脏毒性筛选的模式生物，也具有重要的意义。2.2 药物对
14、肝脏毒性的影响段亚辉等34采用斑马鱼模型比较款冬花、叶的肝脏毒性，观察款冬花和叶给药后3d对健康AB系及转基因系斑马鱼肝、肾形态、肝脏的荧光面积、肝脏丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,A1.T)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AST),结果显示款冬花和叶对斑马鱼肝脏生化指标无显著影响，但款冬花1.5mgm1.组斑马鱼肝脏荧光面积减小，提示款冬花对肝脏产生一定的毒性，款冬叶未表现出明显的肝毒性。全云云等35首次用肝脏荧光转基因斑马鱼Tg(Ifabp：EGFP)对何首乌中的18种成分进行了肝脏毒性研究，检测斑马鱼肝脏表型、面
15、积、荧光强度、肝体比和病理情况等指标，结果发现，何首乌肝毒性的物质基础可能是由葱醍类化合物介导，且以结合葱醍为主，同时发现芦荟大黄素和芦荟大黄素-8-0-葡萄糖昔对斑马鱼体内A1.T、AST、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和总胆红素(totalbilirubin,TBI1.)水平、肝脏组织病理等影响较大，可能是肝毒性主要物质基础36。此外，毗嗪酰胺、香加皮、芫花等对斑马鱼肝脏毒性作用，也取得了一定的成果3740。见表2。表2858鱼在药物肝脏毒性研究中的应用Table2ApplicationofZebrafiShinstudyofdruglivertoxicity药物亚马鱼基t!t
16、pf给药时fm检测指标实验结论文献款冬叶、花Tg(物步：EGFP)、7272死亡料肝脏形态：叶JK荧光IS积：故冬花在离荆量时对肝脏产生一定的毒性，34AB品系A1.T：AST；定马鱼表53培养液而款冬叶未表现出明显的肝脏有性蛋白何苒马Tg(labp：EGFP)7272肝脏表型：舒跳HE染色：肝脏炎光何首日的肝毒性作用可能是由蕙敏炎化合物35馔拈月佛比介导，其物质基明通戢成分有关.同以结合SMK为主何苜鸟Tg(JatplOlEGFP)7224-72甯公多mAB砧系7248在加皮AB品系、Tg(JatplOa：%24dsRM：曲刃：BGFP)毗曜Sl胺AB品系424田芫花AB砧系M24肝脏表型：
17、A1.T：AST；GSH；TBI1.；芦茶大黄素和芦莅大黄素8C司SIIIU可36H三HE染色能是何背马的肝毫性物Jfi基理死亡率：时倍面积:RfiE不透光度:AO南公分多俘对91马鱼的肝脏搅伤主要表现为37荧光染色：QSaSe3和CaSM增加助脏面积和廷迟卵黄囊的吸收,它可替活性的变化；M和即2易因通过激者CaSpaSe*3,促遇促海亡版白BaX的表达的表达诱H腼酬度亡死亡率：肝脏表型：卅踪荧光面积：看E皮木提取物对河马鱼幼鱼的肝脏毒性可38肝脏费光弘电AO荧光染色:SoD：能是通过破糕体内辄化应激午餐,进而GSH：A1.T：AST说等肝脏细胞Ml亡实现死亡率：忖化率：幼鱼形态评分：女曝酰胺
18、对31马鱼胚脂有明显的发华声忖,39行为学分析；ROS1SOD1CAT：并呈剂量和时网相关性,氧化澈在敢曝GSH：MDASt胺发育骞柱中起着直昊的作用死亡率：肝脏表型：肝脏面积：AO芫花水提物对亚马鱼幼鱼的肝脏产生毒牝作40荧光染色：SOD：CAT；A1.T；AST用，其可能是通过破坏具体内氧化应激平密,诱导肝脏细胞均亡CIJPaj半枝区锻3i白薛-3BBveOSygaqCAT-OQbseMDAnukodaUyde2.3 药物对斑马鱼肝脏毒性的作用机制付晓春等37考察雷公藤多背对斑马鱼肝脏损伤的表型及对肝细胞凋亡的影响，结果显示雷公藤多首383、417gm1.时给药2448h显著性增加斑马鱼的
19、卵黄囊面积、增加肝脏面积和延迟卵黄囊的吸收。雷公藤多昔42.5、128、383gm1.连续给药48h后可观察到斑马鱼肝细胞凋亡明显增加，Caspase-3蛋白活性增加，促凋亡蛋白Bax的表达量显著增加，但Caspase-9蛋白的活性以及Bcl-2基因的表达未见明显改变。提示雷公藤多甘的肝毒性机制与CaSPaSe-3蛋白激活，促肝细胞过度凋亡有关。QUan等41用Tg(fabp：EGFP)型斑马鱼研究芦荟大黄素的肝毒性作用及其潜在的毒性机制，结果发现芦荟大黄素的肝毒性机制与核因子B(nuclearfactorkappa-B,NF-B)蛋白的炎症通路和p53基因的凋亡通路的激活有关。3评估药物的肾
20、脏毒性3.1 斑马鱼评估肾脏毒性的优势肾脏是人和高等动物主要的排泄器官，主要滤过血液中的杂质、维持体液和电解质的平衡、药物代谢等，因此肾脏容易成为药物毒性物质累积并引发急性损伤的靶器官。斑马鱼胚胎在24hpf内形成，具有由2个肾单位组成的解剖学上简单的肾上腺，其肾单位结构、功能和分子组成与人类肾脏高度相似42-43,具有排泄水和维持渗透的功能44,故近年来在肾脏发育和肾脏疾病研究中的应用进展有了巨大的增长45-46。渗透压调节紊乱易损伤斑马鱼肾脏，使其肾脏出现不同程度的水肿、组织形态改变等，可通过显微观察或组织病理切片观察肾脏异常,还可通过荧光显微镜观察转基因斑马鱼肾脏的荧光面积，评价肾脏损伤
21、情况。快速、高通量筛选是斑马鱼作为肾脏毒性研究工具的重要优势。3.2 药物对肾脏毒性的影响Hentschel等47利用肾毒性药物第1次成功地构建了斑马鱼急性肾损伤模型，在50、72hpf的斑马鱼胚胎心脏静脉窦内注射庆大霉素或顺伯引起严重的肾小管重吸收功能障碍。梁锦锋等48利用斑马鱼模型评价注射用盐酸万古霉素和厄贝沙坦片的肾毒性，结果发现万古霉素在注射剂量为16.4ng尾时，斑马鱼发育正常，未见明显的毒性，注射剂量在54.7273ng尾，有明显的肾毒性。厄贝沙坦在8.391gm1.时，斑马鱼肾脏均发育正常，未见肾毒性。此外，也有关于中药对斑马鱼肾毒性的相关研究。研究表明，款冬花和款冬叶中含有毒性
22、物质叱咯里西丁生物碱49。段亚辉等34通过款冬花和叶给药后3d对健康AB系及转基因系斑马鱼的肾形态、表型和培养液蛋白量水平进行观察，评价药物肾脏毒性，结果显示各给药组斑马鱼形态无明显的改变，全身或局部未出现水肿，培养液上清中也无蛋白，提示斑马鱼肾小球滤过功能正常，药物对斑马鱼肾脏无明显毒性。说明斑马鱼可作为药物肾毒性的筛选工具。3.3 药物对斑马鱼肾脏毒性的作用机制GorgUIhO等50采用10%庆大霉素、扑热息痛和替诺福韦对斑马鱼幼鱼肾脏的影响进行观察，结果显示庆大霉素和扑热息痛降低肾清除率，扑热息痛和替诺福韦扩大近端小管，其肾毒性机制与线粒体改变有关，包括变形、线粒体肿胀、崎断裂和(或)基
23、质颗粒丢失。王雪等51采用Tg(wtlb:GFP)转基因斑马鱼研究马兜铃酸的肾毒性，发现马兜铃酸4080mol1.处理后斑马鱼的肾出现肾小球囊性膨胀、结构疏松、前肾管上皮细胞细胞排列松散、紊乱及管腔扩张样改变,qPCR检测发现20mo11.马兜铃酸处理24h后nephrin蛋白(nephrin表达于肾小球足细胞，其与裂孔隔膜的形成相关)表达显著降低，表明马兜铃酸诱发肾损伤的原因可能是肾小球足细胞的功能变化。以上结果说明斑马鱼是研究药物对于肾毒性作用的良好模型，并可以利用斑马鱼模型进一步研究药物肾毒性的相关研究。4评估药物的神经毒性4.1 斑马鱼评估神经毒性的优势随着人口老龄化，神经退行性疾病的
24、发生率也逐渐增加。近些年，研究人员发现斑马鱼作为模式生物进行药物神经毒性研究评估较其他模型生物有不可比拟的优势。斑马鱼的中枢神经系统排列、神经形成的过程和具体的机制以及对药物的反应与其他脊椎动物相似，且很多神经退行性疾病蛋白与人类同源52。尽管斑马鱼的神经系统简单，但可以支配复杂的生理活动，还能够对其进行运动、学习和记忆等相关评价53。因此，斑马鱼作为脊椎动物模型被广泛应用于筛选神经系统疾病药物和某些药物神经毒性的研究评估54-55。模式动物斑马鱼的死亡率、孵化率、半数致死浓度(IethalCOnCentratiOn50,1.C50)斑马鱼幼鱼总移动距离和平均速度是评价药物神经毒性的主要指标。
25、4.2 药物对神经毒性的影响二甲基亚飒(dimethylsulfoxide,DMSO)被称为“万能溶剂”，在斑马鱼实验中广泛被用来助溶某些实验试剂56,但目前关于DMSO在斑马鱼体内的神经毒性报道较少。甘津凡等57用0.5%、0.8%、2.5%DMSO对Tg(Vmat2：GFP)斑马鱼胚胎及多巴胺能神经元发育的影响进行了研究，其结果发现DMSO会引起斑马鱼神经毒性，造成间脑多巴胺能神经元丢失及细胞增殖减少，导致胚胎发育障碍。尚楠等58将6hpf的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度氯丙嗪和丙戊酸钠中，结果显示氯丙嗪质量浓度4.0mg1.、丙戊酸钠质量浓度2.0mg1.可引起斑马鱼胚胎出现浓度相关性死亡；氯
26、丙嗪和丙戊酸钠质量浓度达到2.0mg1.时可显著降低斑马鱼幼鱼总移动距离和平均速度，且丙戊酸钠毒性大于氯丙嗪。曹建斌等59观察丙泊酚5、10、20gm1.对斑马鱼胚胎运动神经元发育的影响，结果显示丙泊酚5gm1.组胚胎整体形态发育正常，但运动神经元发育受到抑制，丙泊酚10、20gm1.组胚胎发育停滞在原肠胚时期。提示丙泊酚暴露可抑制斑马鱼运动神经元的发育。刘静等60研究牛黄镇惊丸对斑马鱼胚胎发育的影响，结果显示质量浓度低于200gm1.时，未见胚胎发育异常。质量浓度高于200gm1.时，胚胎头眼发育较小，瞳孔无色；心脏畸形、心率较弱、血流受阻；尾干扭曲，卵黄囊延伸结构变粗，脊索变细等。说明牛黄
27、镇惊丸质量浓度大于200gm1.时对斑马鱼胚胎的神经系统、心血管系统和骨骼等发育均有影响。4.3 药物对斑马鱼神经毒性的作用机制王狮昊等61以斑马鱼为动物模型研究乌头碱0.1、0.5、1、10、100molm1.的神经毒性并初步探索其神经毒性的致病机制，结果发现乌头碱浓度大于0.5molm1.时可呈剂量相关性的显著性降低斑马鱼游泳活力、幼鱼的肌节长度，抑制Rohon-Beard神经元的生理性凋亡，推测其神经毒性与抑制乙酰胆碱酯酶活性有关。但有研究认为，药物的神经毒性机制与提高乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)活力有关。朱璧然等62研究氯硝柳胺5、10、2040、
28、80g1.对斑马鱼幼鱼的神经毒性，结果显示氯硝柳胺40、80g1.处理幼鱼存活率降低、畸形率增加、运动速度降低，且幼鱼微球蛋白前体(microglobulinprecursor,mbp)和微球蛋白mRNA表达降低、AChE活力增加。顾杰等63采用幼鱼染毒、运动行为学测试和胚胎整条原位杂交等实验以及荧光定量PCR手段，来研究双酚AP(bisphenolAP,BPAP)和双酚AF(bisphenolAF,BPAF)对斑马鱼早期神经发育和行为的影响,发现BPAP和BPAF可扰乱斑马鱼运动轨迹，降低平均运动速度和移动距离，使其出现呆滞现象，推测其神经毒性机制与抑制斑马鱼神经发育关键基因mbp和突触蛋白
29、基因(SynapsinIIa,syn2a)的表达有关。王雪等64研究冈田酸0.05、0.100.20mol1.对斑马鱼幼鱼神经行为功能的影响，结果显示0.05、0.10mol1.冈田酸处理后幼鱼存活率、游动轨迹无明显差异。但0.20mol1.冈田酸处理后幼鱼存活率、游动活力、游动距离明显降低，呆滞时间明显延长，且幼鱼体内蛋白磷酸酶2A(proteinphosphatase2A,PP2A)表达水平明显下调，a7烟碱型乙酰胆碱受体(7nicotinicacetylcholinereceptor,7-nAChR)基因表达水平则无明显改变。说明冈田酸的神经毒性与PP2A基因相关。5评估药物的脾脏毒性脾
30、脏是斑马鱼重要的免疫器官，主要起调控免疫作用，在对抗外来抗原方面至关重要。郑美娜等65探索香泽兰总黄酮对斑马鱼脾脏显微组织结构的毒性作用结果发现，随着香泽兰总黄酮水触媒染毒浓度的增加，斑马鱼脾脏显微组织结构出现了不同程度的病变，主要表现含铁血黄素沉着增多，脾窦扩张，脾脏内淋巴细胞增多，血细胞核浓缩、溶解，甚至导致脾脏坏死。说明模式生物斑马鱼是可以用来作为药物脾脏毒性研究评估的实验模型。6评估药物的急性毒性6.1 斑马鱼评估药物急性毒性的优势安全性和有效性是药物的两大基本属性，而我国传统中药，成分复杂、配伍多样，为避免临床使用中的不良反应，对药物进行临床前毒性评价和安全性评估显得尤为重要。急性毒
31、性实验是评价药物安全性的主要指标，对阐明药物的毒性作用和探索其毒性靶器官具有重大意义66。与其他模型动物相比，斑马鱼具有发育快、易获取、易观察、易检测等显著的优势，其胚胎也被广泛应用于药物早期急性毒性研究评估。在斑马鱼急性毒性试验中，常选用1.C50来表示该药物的急性毒性大小。6.2 药物对急性毒性的影响陈宏降等67研究鱼腥草地上部分、鱼腥草根茎、三白草地上部分、三白草根茎的95%乙醇提取物对斑马鱼成鱼和胚胎的急性毒性，发现4种药物的1.D50分别为2.85、10.40、2.54、1.19mg1.,且致畸主要表现为心包和卵黄囊水肿，提示这4种药物的急性毒性主要体现在心脏。熊关庆等68研究了和厚
32、朴酚0.1、0.2、0.40.6、0.8mg1.对斑马鱼的毒性损伤，发现和厚朴酚处理96、72、48、24h后1.C50分别为(0.5300.014)(0.6790.013)(0.758+0.012)(0.8160.01)mg1.,其安全浓度为(0.2640.003)mg1.o和厚朴酚处理斑马鱼后虽未出现明显的临床病理变化，但组织病理学显示斑马鱼的鲤和脑出现充血，还可见鲤呼吸上皮坏死，提示鳏和脑可能是和厚朴酚对斑马鱼的主要毒性靶器官。林青华等69通过比较槟榔不同炮制品对斑马鱼的1.C50值及其生物碱、糅质类成分的含量，探讨槟榔的毒性成分，发现生槟榔、炒槟榔和焦槟榔对斑马鱼幼鱼的1.C50值分别
33、为29.7432.47、40.03gm1.,水提物中总生物碱的含量依次为生槟榔炒槟榔焦槟榔，总糅质含量依次为炒槟榔生槟榔焦槟榔，提示炒槟榔、焦槟榔的急性毒性较生槟榔低，且生物碱类成分可能是其毒性成分。费倩倩等70采用代谢组学的手段研究三七总皂昔给药Id后对TUebingen品系斑马鱼胚胎急性毒性作用及可能机制，结果表明，随着三七总皂昔给药时间的延长，斑马鱼幼鱼内源性代谢物的改变越加明显，且呈现出时间相关性代谢轨迹，提示三七总皂昔给药剂量越大，斑马鱼幼鱼出现毒性症状的时间会大大缩短，且给药时间越长，体内代谢更紊乱。揭示了三七总皂昔过量所出现的急性毒性可能与脂质代谢、氨基酸代谢以及能量代谢等代谢通
34、路的紊乱有关。此外，I-蔡酚、醋酸甲羟孕酮、姜黄素等对斑马鱼急性毒性研究也取得了一定的成果70-76。斑马鱼在药物急性毒性中的研究见表3o表3斑马鱼在药物急性毒性中的研究Table3SnIdyofzebrafishindruMUrecoxki11药物河马鱼基因Kf给药时间b检测指标文险结论文献tfi_TuebmgB品系24120代）轮牌分析：PCA分析：时间一三七总也3过量数4可能与瓶炭代遨、51基般70iflOP1.SDA分析；灌在生物标志代谢以及能量代升等通路的素乱有关物锦选：代诺通踣分析1茶的TUeEa品系2496畤形率；斗化率JC,：ROS：VDA：1.余酚胚胎期品需对理马鱼发育的毒性
35、作用71GSHi-SH;SOD：CAT：CaSPse3、可能卬-余粉诱导的乳化应激有关BsS白的规18酸甲双孕第ABAJg2472崎彩串：死亡数：1.Dsc%化数：Ifi箧甲用孕IH的急性毒性1.DMa以及胚胎致72发育退级胚胎数形事值四小骨刺片TUlma品系666TD：1.D：畸形率：死亡率：胚骨上片对SE马色胚8&发育影响均表现为海浓73胎发育情况：Up1.CQOFMS定度下的致死作用性分析麦考蛤酸Tuebma品系2IlS存活率：*形率：软骨染色：麦考的酸通过下调IMPDH基因.抑WIMPDH74IMhIb、adh2荔园的表达活性,从而造财马鱼姓胎的博面部发。崎影双酚STebma品系249
36、6活卵率；死卵率：斗化率斑马鱼任龄在双弊中急性M为h.於黔发75有我影胴.其毒性效应还具有可蔻传性圣黄素AB品系72、12024*%死亡率；畸形率；畸形形态：得化赞黄素对薄马鱼胚胎及幼鱼有一定的急性寄76*：1.Cw：ECw:TI性及致崎作用,作用F由和幼做的最大安全浓度分别为IM4mdHTDa*H中毒剂*ECk*JRt4技度IC“*JS界割米度ispftlb-IMP(AMMK)R%IbIapa2IMP(次黄口中0艘法里2NPDK-IMPGtRQ*A*)RK11-*ISaH-seeIIKoC合取Utt)&IydrogtsaseIbunpd2-BP(DomeaxgCGlte)deb-dogeus
37、dex7结语及展望斑马鱼作为一个整体的模型生物，具有易于养殖、给药量少、成本廉价、毒性评价指标多样化等特点，其胚胎和幼鱼可作为高通量药物筛选的实验模型，既弥补了细胞模型的单一性，又弥补了啮齿动物模型的长时间性，符合动物福利的“3R”（减少、替代和优化）理论，被广泛应用于药物和环境污染物的毒性研究,特别是对我国具有分类庞杂、种类繁多和成分复杂的传统单味中药、复方和中成药的毒性作用评估。此外，模式生物斑马鱼在药物活性物质筛选研究、疾病机制研究、药物体内代谢研究和药物作用机制研究等方面也发挥着越来越重要的作用。总结文献资料显示，药物毒性研究主要集中于斑马鱼心血管、肝脏、肾脏、神经、脾脏等方面，其主要
38、表现为死亡率和畸形率增加、器官形态和表型改变、可能伴有水肿等发生等。部分研究从整体情况探讨了药物的器官毒性，少部分研究探索了药物毒性机制，总结发现其主要影响细胞凋亡、炎症以及特异性表达蛋白或酶等，影响斑马鱼胚胎或幼鱼的发育从而产生一定的毒性。目前斑马鱼在中药毒性研究中的应用还处于探索阶段。在已有的很多文献报道中，采用斑马鱼对中药、中药复方或中成药进行毒性及其机制研究时，大部分都只是针对中药里面的全部成分或个别单体化合物进行毒性检测。而中药或复方中包含成百上千种的化合物，各化合物之间可能通过多种途径、多个靶点以及多个环节对机体造成不可逆转的毒性作用。同时，在中药或复方的相关研究中，应考虑斑马鱼模
39、型是否具有代表性以及所测定的指标是否具有针对性。如何更简单、更高效的利用模式生物斑马鱼明确某些中药或复方中的毒性作用、作用靶点以及具体的毒性机制还需要更进一步的拓展研究。通常情况下，器官毒性相关指标的评价都在整体组织处理后获得的，除神经系统毒性研究有少量特异性指标，其他器官毒性的特异性指标有待进一步发现，故在此后的研究中可考虑采用蛋白组、转录组、代谢组等多组学技术研窕分子信号通路探索药物毒性作用靶点或机制尽管斑马鱼模型在评估药物毒理学方面表现出独有的优势，但是由于与人类物种间的差异，斑马鱼模型也存在一定的局限性。（1）在解剖结构上，斑马鱼血管直径3050m,且血液量少，在检测血压及采血方面难以
40、实现；斑马鱼的呼吸系统与哺乳动物大不相同，且内脏形成较哺乳动物晚，一般发生于体节发育中期；与哺乳动物由单一始基发育形成不同，斑马鱼的消化系统由不同始基形成，故目前对斑马鱼呼吸和消化系统的药物筛选研究较为困难；（2）在基因层面上，斑马鱼基因虽与人类基因高度相似，但也存在差异，不少基因功能与人体差异明显，为更好探究不同基因的作用，可采用斑马鱼配合其他动物模型，特别是哺乳动物（如小鼠等）模型进行进一步的验证。同时，斑马鱼实验动物未实现标准化，没有统一的规格和质控方法，故药物研究结果的稳定性和重复性值得研究者思考。此外，目前只有少量的文献报道过关于斑马鱼胰腺、脂质代谢和免疫系统方面的毒性作用，笔者猜测
41、其可能的原因是这些器官和系统的代谢紊乱很难在光学显微镜下被观察到77。然而，人类的这些器官和系统是常被怀疑为毒性物质暴露的靶点，这些靶点可能与人类某些疾病的发生有密切联系。因此，这些亟待解决的疑难问题依旧是今后科研人员重点研究的对象。综上所述，在众多的模型动物中，斑马鱼作为一种评估药物安全性与毒性最为高效、快速、便捷的方法，可以阐明药物具体的毒性作用及其多组分多靶点的毒性作用机制，目前已受到了医药学界和科研学界的广泛关注。随着人类社会科学技术的不断发展和创新，这一新兴的模式生物在药物毒性研究领域将会有更加广阔的应用前景，同时也为推动中药的研究与开发提供新的思路和新的平台。附参考资料：斑马鱼在药
42、物发现毒理学中的应用在药物发现中，在早期基于靶点或表型的候选药物筛选中发现的化合物数量远远超过了作为临床候选药物取得进展的数量，其中临床试验进展相对较少甚至没有。它们在药物开发过程中发生的越晚，意外安全事件在人类健康和金钱方面的代价就越大。改进临床前测试实践可以减轻这种损失。旨在降低安全性并揭示发现候选者的毒性机制的研究毒理学的进展为这种改进提供了途径。其中许多包括被视为动物模型替代品的平台，符合动物研究的3R理念。其中包括干细胞和其他细胞培养物,3D组织模型,芯片上的器官,在计算机预测中，和机器学习以及用于更多可翻译数据的人源化嵌合小鼠模型和在动物中进行的非哺乳动物动物测试，如线虫和硬骨鱼斑
43、马鱼为药物发现毒理学提供3RS价值。研究中动物研究的3R,替代、减少和改进，随着时间的推移，随着使用动物、监管指令和新技术的基本理念的发展，后者可能对科学和动物福利有益。在新方法中，斑马鱼已成为一种流行的替代动物模型。根据2010年的欧盟委员会指令，一些动物最早生命阶段的实验不属于动物研究；对于斑马鱼来说，受精后5天左右开始的独立喂养（dpf）被认为是动物实验监管的第一阶段。因此，使用5dpf下的斑马鱼胚胎/幼虫可以被认为是动物试验的替代方法。围绕这一点存在一些争议；国家和地区当局对标准有不同的解释，特别是在受精后120-144小时(hpf)左右。根据对文献和可用数据的回顾，支持5dpf过渡，
44、其中包括蛋黄消耗、喂养和游泳行为等标准，独立喂养在120hpf时变得明显。3RS如何应用于斑马鱼替代：使用斑马鱼幼虫的斑马鱼测定可用于替代一些动物毒性研究，首先通过验证研究确定斑马鱼幼虫是系统(靶标、基因、途径、机制、组织、器官等)的相关模型。减少：作为毒性的一级模型，斑马鱼幼虫可用于识别有毒候选药物，从而允许在哺乳动物模型中测试更安全的分子。最后，这将最终减少用于测试的动物数量。细化：胚胎和幼虫斑马鱼模型为动物研究设计提供了细化，因为胚胎在外部受精并且在生命的早期是透明的。这允许无创观察毒性并可能恢复。斑马鱼作为动物模型的挑战Stimulus11SocialzoneFocalfish/uNo
45、n*socialzoneArena斑马鱼作为模式生物的主要优势之一是体型小，这也带来了挑战。依靠非临床毒理学研究来预测有效和毒性暴露之间的治疗窗口，根据这些暴露指导临床剂量上限，并提供吸收、分布、代谢和排泄(ADME)数据。目前，斑马鱼幼虫研究产生的水中有毒剂量水平与哺乳动物血浆水平无法确定相关；在这个领域需要做更多的工作，就像关于水中剂量驱动的独特暴露的问题一样，可能取决于被询问的系统。目前正在研究测量斑马鱼幼虫血浆水平和ADME的方法，但仍处于早期阶段。斑马鱼作为动物模型的价值保存的脊椎动物生物学、易于饲养、高繁殖力、小尺寸、快速发育和透明的幼崽是斑马鱼作为毒理学研究中哺乳动物替代品的一些
46、主要吸引力。尽管与水生物种相关的解剖学和生理学存在一些重大差异，但大多数斑马鱼器官与人类器官具有相同的功能，并表现出保存完好的生理学。数百只成年斑马鱼，每条只有约4厘米长，可以很容易地饲养在标准水族箱中，并且有多种商业选择用于自动水质控制和喂养。一对成功交配会产生数百个快速发育的外部受精胚胎。在48到72hpf之间的早期发育期间，大多数器官的发育几乎完成，除了胃肠道(Gl)道中的器官。76hpf后，肝脏、胰腺和肠道完全发育，96hpf时，胃肠道完全发育。由于在这个阶段它们足够小，可以放入多孔板的各个孔中，因此可以在手持平台上对数百个完整的生物体进行毒理学研究，使用的测试物品数量仅需要对一只或两只小鼠进行给药。斑马鱼在动物模型中的应用1、斑马鱼胚胎越来越多地用于候选药物和化学品的发育毒性筛选。2、斑马鱼被广泛应用于研究神经系统疾病和疾病的机制和发病机制，在该领域的药物发现和毒性测试方面具有很大的前景。3、脊椎动物的眼睛高度保守；因此，斑马鱼为研究眼毒性提供了一个极
