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1、冰水混合物结合溶菌酶对菠菜品质及硝酸盐含量的影响甘肃省是蔬菜大省，主要以高原露地夏菜为主，6-9月份上市，由于海拔高、气候冷凉、光照充足等特点，蔬菜色泽好、营养丰富，具有明显的品质优势，主要销往沿海以及东南亚等80多个大中城市，很好地填补了我国东部及南方蔬菜“伏缺季节的市场供应，形成了富有地域特色的“高原夏菜”品牌，是全国重要的高原夏菜和西菜东调基地1。夏菠菜是甘肃高原夏菜的主要蔬菜品种，其富含类胡萝卜素、VC,色泽好、营养丰富，具有明显的品质优势。而高原夏菜采收期正值高温炎热季节，较春秋蔬菜采后更易黄化和腐烂，积累亚硝酸盐，尤其贮藏条件不当时，甚至会引起数倍或数百倍的累积2。因而菠菜的采后保
2、鲜是生产实践中亟需解决的难题。冰水混合物(0)处理作为一种蔬菜的物理保鲜手段，是将新鲜的蔬菜放入冰水体积比例为1：1的混合物中浸泡，使蔬菜的温度瞬间达到0,降温速率快，使蔬菜的呼吸作用很快降到最低，是一种安全、绿色的保鲜手段。臭氧作为一种强氧化剂，具有良好的杀菌防腐作用且无残留，在食品行业得到广泛的应用3。Feliziani等对冷藏(2C)期间的鲜食葡萄采用低质量浓度(0.075-0.500mg1.)持续的臭氧处理，结果表明，低质量浓度持续的臭氧处理可以抑制受感染果对健康果粒的侵染；李珍等选用间歇式臭氧处理冰温条件下贮藏的红提葡萄，结果表明，随着贮藏时间的延长，臭氧处理降低了红提葡萄的腐烂率、
3、落粒率，能有效保持好果率，延缓葡萄果实的衰老和品质劣变，减缓由质量损失引起的新鲜度下降。王瑾等研究发现采用高浓度臭氧水保鲜鲜切花椰菜利大于弊，所以在鲜切花椰菜的加工工艺中宜采用高浓度臭氧水短时间的处理方案。Selma等用不同浓度的臭氧水处理鲜切其笋，结果表明，5.41.1.的臭氧水杀菌效果最好。溶菌酶是一种能水解细胞壁肽聚糖的比较稳定的碱性蛋白酶,主要通过切断细胞壁肽聚糖中的N乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的B1.,4-糖汁键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，细菌裂解。己有报道称，T4溶菌酶因具有两亲性质的C端，可以直接干扰细菌、真菌和植物细胞的膜活性，进而抑制微生物生
4、长，并非通过溶解细胞壁发挥抑菌活性。溶菌酶作为抗微生物药物具有良好的生物相容性，至今未出现耐药现象10-11。己有许多将溶菌酶应用于水产品防腐保鲜中的研究，Hikima等12通过对日本对虾的C型溶菌酶的研究证实,该溶菌酶对多种弧菌及鱼类的病原菌具有不同程度的杀菌作用。De-la-re-vega等13利用溶菌酶保鲜液对南美白对虾进行研究，实验表明，溶菌酶保鲜液抑制弧菌属生长的效果与抑制滕黄微球菌的效果相当,也有研究将溶菌酶与保鲜剂以及保鲜技术相结合，Ozogul等口4利用真空包装和气调包装(modifiedatmospherepackaging,MAP)对沙丁鱼进行包装，得出MAP比真空包装沙丁
5、鱼的货架期延长3d,并且MAP中的细菌繁殖要缓慢得多，进一步证实了MAP技术的价值。Fern3ndez等15将溶菌酶与气调包装结合，使大西洋雄鱼片的货架期延长。溶菌酶在果蔬的保鲜中也有一定的应用。张迪等16研究1-甲基环丙烯(1-methylcyclopropene,I-MCP)结合溶菌酶处理对苹果保鲜效果的影响，结果表明，1.5u1.1.lMCP和质量分数0.08%溶菌酶处理能有效提高苹果的商品品质。周林宗等1刀利用溶菌酶、海藻酸钠和壳聚糖复配保鲜液对油桃进行保鲜处理，结果发现含质量分数1%的壳聚糖、007%的溶菌酶和1%的海藻酸钠的复配保鲜液对油桃保鲜效果最好，能有效延缓质量损失率的上升及
6、可溶性糖、VC含量的下降，降低了果实腐烂指数及呼吸强度。范林林18研究了热处理、柠檬酸、溶菌酶、D-异抗坏血酸钠、壳聚糖等处理对鲜切寒富苹果的保鲜防腐效果，结果表明，溶菌酶处理能有效维持鲜切苹果的外观品质，抑制相对电导率、丙二醛含量、多酚氧化酶活性及菌落总数的增加，显著维持了过氧化物酶(peroxidase,POD)活性，质量分数008%溶菌酶保鲜效果最佳。溶菌酶在蔬菜防腐保鲜中的应用研究鲜见报道,本实验通过溶菌酶结合冰水混合物处理、臭氧水处理及溶菌酶处理3种方法对新鲜菠菜进行处理，研究不同处理方法对菠菜贮藏期品质及硝酸盐含量的影响，以选出适合菠菜保鲜的方法，为减少化学保鲜剂的应用，开发简便、
7、安全的菠菜贮藏保鲜技术提供理论依据。1材料与方法1.1 材料与试剂实验所用新鲜的夏菠菜采自高原夏菜主产区,挑选长势均匀一致的菠菜,早上7点取样，样品取好后装入泡沫箱内及时拉回放入冷库进行处理。溶菌酶生物科技有限公司；淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清诺维信（）生物技术有限公司；甲醇（色谱级）、璘酸二氢钾、B筑基乙醇、抗坏血酸美国赛默飞世尔科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。1.2 仪器与设备WSC-S色差计精密仪器仪表有限公司；SQP型电子天平赛多利斯科学仪器O有限公司；Cary-100型紫外可见分光光度计、1200高效液相色谱仪美国安捷伦科技有限公司；TG1.-16M台式离心机科学仪器有限公司；HH
8、-S6型电热恒温水浴锅仪器有限公司；HY-Ol9-2OOA臭氧发生器电器科技有限公司。1.3 方法1.3.1 菠菜处理本次实验所用的臭氧发生器开机0.5h后，臭氧水中臭氧质量浓度稳定在3mg1.左右，用臭氧水与水按比例混合得到2.3mg1.的臭氧水。将挑选的菠菜放置在白色小塑料筐中，每筐50Og左右。按以下分组进行相应处理：第1组，常温蒸馆水处理，作为CK组；第2组,质量浓度为lg/1.溶菌酶处理；第3组，23mg1.的臭氧水处理（根据本课题前期臭氧水在叶菜类最佳保鲜质量浓度确定）；第4组，将Ig的溶菌酶溶解到冰水体积比为1:1的总体积为100Om1.的冰水中，配成溶菌酶质量浓度为lg/1.的
9、冰水混合物，作为冰水+溶菌酶处理组。将菠菜分别放入以上4组处理液中浸泡IOmin,自然风干后，装入27cm19cm20cm聚丙烯密闭箱内，放入4的生化培养箱，设3组平行，每2d取样，所取样品放入一26C内保存，进行各指标的测定。1.3.2 色泽的测定将处理好的贮藏期的菠菜，每个处理选取3株，标记同一块叶片，用于菠菜色亮度1.*值、红绿度a*值和黄蓝度b*值的测量，分别按照公式（1）、（2）计算色差E和色调角H值。f=,1.*1+2+6*2（1）br=arctan-（2）式中：A1.*、a*,Ab*分别表示样品测定值与鲜样差值；H值变化范围在0。180。之间，颜色变化依次为紫红、红、橙红、橙、黄
10、、黄绿、绿和蓝绿，当H=0。时为紫红色；H=90时为黄色；H=I80。时为绿色；H100。时，H值越大，果实绿色越深；HV50。时，H值越小，果实红色越深。133叶绿素、VC含量的测定参照NY/T30822017水果、蔬菜及其制品中叶绿素含量的测定分光光度法19,使用分光光度法测定叶绿素的含量。VC含量采用2,6-二氯靛酚滴定法测定。134可溶性糖质量分数、可溶性蛋白含量的测定可溶性糖质量分数采用意酮比色法20；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法21。1.3.5 叶酸含量的测定菠菜中叶酸的提取参考孟繁磊等22的三酶法。称取粉碎后菠菜样品0.2g于2m1.离心管中，加入750H1.磷酸盐缓冲溶液（含
11、质量分数1%抗坏血酸钠盐和0.1%.毓基乙醇），95C水浴孵育15min后于冰上冷却，之后加入Smm钢珠，在组织研磨机中14000rmin研磨样品Smino匀浆液中加入750H1.上述磷酸盐缓冲溶液和适量淀粉酶，静置Iomin,加入适量蛋白酶，37培养lh；100煮沸Iomin；冰上冷却后在4、14000rmin离心IOmin；吸取上清液，在上清液中加入适量大鼠血清，混匀后，于37培养2h；100C煮沸灭活Iomin,冰上冷却Ih后4、4000rmin离心15min,所得上清液即为叶酸提取液；吸取上清液分装于灭菌管中直接测定或冻存于一80。样品提取过程均需在避光下操作。叶酸含量测定采用高效液相
12、色谱法，色谱条件：流动相为0.01mol1.KH2P04-CH30H溶液(体积比为89：11,pH63);柱温25；流速为l.Om1./min；进样量为20山紫外检测波长28Onm；C18色谱柱(4.6nm150nm,5m)0136草酸含量的测定草酸含量测定参照曾芳等23的分光光度法。取0.5g样品，在液氮中迅速研磨至粉末状，加入0.5m1.蒸馈水转移至Iom1.离心管，70C水浴加热30min,并摇动数次。取出后冷却过滤，取滤液2m1.,分别加入2m1.0.5mgm1.FeCI3溶液、20m1.0.2mol/1.PH2的KCI缓冲液、1.2m1.质量分数65%的磺基水杨酸，并用蒸储水将体系定
13、容至25m1.。显色30min后，以蒸储水为参比，在51Onm波长处测定吸光度，并计算样品中的草酸含量。137硝酸盐、亚硝酸盐含量和硝酸还原酶、POD活力的测定硝酸盐含量的测定参考GB5009.33-2016食品国家安全标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定中的紫外分光光度法24；亚硝酸盐含量采用盐酸蔡乙二胺法25测定。硝酸还原酶活力的测定：取4份Ig菠菜样品剪碎混匀，剪成ICm左右小段，放于塑料离心管中。其中1份做对照，另外3份做晦活力测定。在对照管预先加入1m1.、质量分数30%三氯乙酸，然后在各管中都加入9m1.0.1mol/1.KNO3溶液。混匀后立即放入真空干燥培养箱内，抽真空Imin,再
14、通气，反更3次以上以便排出组织间隙的气体，使底物进入组织。最后通入氮气密封后，并在25黑暗中反应0.5h,再分别向测定管加入1m1.、质量分数30%三氯乙酸，以终止酶反应。吸取2m1.反应液，加入Im1.、质量分数1%磺胺和Im1.、质量分数1%的蔡胺显色15min后，4000rmin离心5min,取上清液于54Onm波长处测定其吸光度。硝酸还原酶活力以每克鲜质量样品每小时产生NO2一的质量计，单位为ug(gh).POD活力参考ZhangYongfu等26的方法。1.4 数据统计与分析所有实验在取样时进行3次生物学重复，指标测定时进行3次技术重复，实验结果表示为平均值土标准差。所有数据利用Or
15、igin8.5软件进行整理并作图。通过SPSSl9软件的DIJnCaMS多重比较法分析差异显著性，PVo.05表示差异显著。2结果与分析2.1 菠菜贮藏期间的色泽变化tfHCK6QJ2I.的-63SIAr2825I.WIO7.1O7JJtI269OOO2lgt三Ni56715?-10*1.86*22.984.%*IB579(tf13仙士00k”刖K水505914fc-1118*2.63*23.22i5,ltf11110+13414.(WOdOI47.76l,45-20.8911.89*I9.I715I,120.086.20*I65IOO.(M2,表1不同处理对菠菜贮藏期间色泽的影响Tablel
16、Effectofdifferenttreatmentsoncolorparametersofspinachduringstorage叶片的颜色直接影响菠菜的感官品质。由表1可知，4个处理中，冰水+溶菌酶处理组的平均1.*、a*和b*值显著低于其他3个处理组，H值显著大于其他3个处理组，平均AE分别比lg/1.溶菌酶、2.3mg1.臭氧水及CK组高14%、17%和30%。这说明冰水+溶菌酶处理的菠菜在贮藏期叶片最绿，亮度最亮，因此与其他处理方式相比，冰水+溶菌酶处理能显著保持菠菜贮藏期的色泽，延长其货架期。2.2 菠菜贮藏期叶绿素、VC含量的变化HX=UHCJCK-冰水+溶菌陶Ig/1.溶菌险2
17、.3mg1.!l水贮藏时间/dA飞1.二,二二r0987654321O.SO.SSO.SO.S(Mum-CK-冰水+溶菌陶1.1g/1.溶菌的一2.3mg1.!似水JIIII2468IO贮藏时间阻同贮藏时间小写字母不同衰示差异显著(PVO.05).卜同图1菠菜贮藏期间叶绿素（八）、VC(B)含量的变化Fig.lChangesinchlorophyll（八）andVC(B)contentsinspinachduringstorage叶绿素作为分布最广泛的色素直接影响绿色蔬菜的颜色品质。由图IA可知，叶绿素含量在整个贮藏期间呈下降趋势；CK组在整个贮藏期间叶绿素含量下降速率最快，而lg/1.溶菌酶
18、和臭氧水组之间差异不显著，溶菌酶+冰水组在整个贮藏期间叶绿素含量显著高于其他处理组(PV0.05)；贮藏第8天时，CK组的叶绿素含量比冰水+溶菌酶组低66%,这说明溶菌酶+冰水处理能有效延缓菠菜贮藏期间的黄化速率。VC在菠菜贮藏过程中易被氧化破坏，其含量可作为衡量菠菜营养价值的重要指标。由图IB可知，VC含量的变化趋势与叶绿素含量变化一致，都呈下降趋势，除CK组外，其他3个处理组贮藏前4d的VC含量无显著差异，在贮藏的48d,溶菌酶+冰水组的VC含量显著高于其他3个处理组，且在贮藏第10天时，CK组的VC含量比冰水+溶菌酶组低35%。这是因为冰水处理能使菠菜的温度迅速降到0,使菠菜的氧化速率显
19、著降低，VC不易被氧化破坏。2.3 菠菜贮藏期间可溶性糖质量分数、可溶性蛋白含量的变化图2菠菜贮藏期间可溶性糖质量分数（八）、可溶性蛋白含量（B）的变化Fig.2Changesinsolublesugar（八）andsolubleprotein（B）contentsinspinachduringstorage由图2A可知，可溶性糖质量分数在整个贮藏期间呈现先增后减的趋势，前4d,各处理组的可溶性糖质量分数无显著差异，从第4天开始，溶菌酶+冰水组的可溶性糖质量分数显著高于其他3个处理组，且在贮藏第6天时比CK组高52%,说明溶菌酶+冰水处理能抑制菠菜贮藏期间可溶性糖质量分数的下降。可溶性糖是蔬菜
20、中的一种重要营养物质，相关研究认为蔬菜中可溶性糖含量在常温贮藏条件下先升高再降低，呈上升趋势是因为在酶的作用下,淀粉等多糖类水解,后期在微生物分解下可溶性糖含量下降2729,与本实验结果基本一致。可溶性蛋白含量是衡量植物适应逆境环境情况的一个重要指标，能反映植物体的代谢强度，可溶性蛋白在参与新器官形成的同时，可宜接调控参与各种生化反应的能30.由图2B可知，整个贮藏期间可溶性蛋白含量呈现先升高后降低的趋势，前期增加是由于各组低温贮藏的菠菜对逆境具有抵抗力，能通过保护自身细胞维持代谢能力，在贮藏后期，菠菜可能因为失水、腐烂，组织开始衰老，保护能力降低，可溶性蛋白含量降低。从增长趋势来看，冰水+溶
21、菌酶组从贮藏第4天开始可溶性蛋白含量显著高于其他3组（PV0.05）；这说明，冰水+溶菌酶处理能使菠菜在贮藏期间维持较低的代谢水平。2.4 菠菜贮藏期间叶酸、草酸含量的变化(MOOU毁)、堪侬髭-CK-冰水+溶菌酶贮藏时间/d(MgE)、螭依髭神图3菠菜贮藏期间叶酸（八）、草酸(B)含量的变化Fig.3Changesinfolicacid（八）andoxalicacid(B)contentsinspinachduringstorage菠菜中含有丰富的叶酸，但叶酸会随着贮藏时间延长不断损失。由图3A可知，在整个贮藏期间，叶酸含量均呈下降趋势，贮藏到第10天时，CK组的损失率最高，为49%,其次是
22、lg1.溶菌酶和臭氧水组，分别为34%、40%,冰水+溶菌酶组在整个贮藏期间叶酸含量损失最低，损失率仅为25%o由此可见，冰水+溶菌酶能明显抑制菠菜贮藏过程中叶酸含量的下降。菠菜含有的大量草酸被认是一种抗营养物质和有毒物质3132。由图3B可知，草酸含量随着贮藏时间的延长呈现不断增长的趋势，贮藏第10天时，CK组草酸含量最高，与Od相比提高了1.6倍，其次是lg/1.溶菌酶和臭氧水组，分别提高了1.4、1.3倍，而冰水+溶菌酶组仅提高59%。由此可见，冰水+溶菌酶可抑制菠菜贮藏过程中草酸含量的上升。2.5 菠菜贮藏期间硝酸盐、亚硝酸盐含量的变化-CK-林木+港荫能46raHrHjdBlwR匕M
23、里齿3-c-imwftlg1.潘俏/T-Z3mg1.!M水b-I11146SIO_Ig/1.潘儡的23mW1.iiW水图4贮藏期间菠菜硝酸盐（八）、亚硝酸盐(B)含量的变化Fig.4Changesinnitrate（八）andnitrite(B)contentsinspinachduringstorage由图4A可知，在整个贮藏期间，4组菠菜硝酸盐含量随贮藏时间的延长呈现先快速上升后稍下降，再上升或平稳的基本趋势。从总体上看，前4d变化幅度较大，第2天含量达到最大，CK组含量变化最明显，冰水+溶菌酶组变化最小。总体来看，在整个贮藏期间，冰水+溶菌酶组硝酸盐含量都显著低于其他3组(P0.05),
24、尤其在第2、4、8天最明显，并且始终保持较低水平。由图4B可知，随着贮藏时间的延长，4组亚硝酸盐含量呈上升.下降.上升的趋势。第2天达到峰值，随后开始下降，到第6天后又开始上升；第8天时，冰水+溶菌酶组亚硝酸盐含量为1.49mgkg,较CK组低31%。总体来看，CK组亚硝酸盐含量始终高于其他3个处理组，而冰水+溶菌酶组在整个贮藏期间都显著低于其他3组。2.6 菠菜贮藏期间硝酸还原醒、PoD活力的变化(En)ZMod图5菠菜贮藏期间硝酸还原酶（八）、POD(B)活力的变化Fig.5ChangesinNR（八）andPOD(B)activityinspinachduringstorage由图5A可
25、知，菠菜硝酸还原酶活力随着贮藏时间的延长而下降，刚采收的菠菜具有很高的硝酸还原酶活力，但贮藏至第2天时，CK组的硝酸还原酶活力与初始(Od)相比降低34%,而冰水+溶菌酶组仅降低5.2%,两者差异极显著(PV0.01)。总体来看，冰水+溶菌酶处理能显著抑制硝酸还原酶活力的下降，而硝酸还原酶能催化硝酸盐还原成亚硝酸盐，因此从理论上讲，生成的亚硝酸盐总量大于CK组，而本实验中亚硝酸盐累积量较CK组低，这是因为冰水+溶菌酶处理不但提高了硝酸还原酶的活力，同时还可能协同提高了亚硝酸还原酶的活力，使亚硝酸盐(N02-)较快地合成NH4+,从而使亚硝酸盐的累积总量处于较低的水平。POD是植物体内抵御活性氧
26、伤害的重要酶类，POD对减少活性氧积累、抵御膜脂过氧化和维护膜结构的完整性有重要作用3334。由图5B可知，刚采摘的菠菜PoD活力较低，在贮藏期间，CK组和3个处理组的POD活力总体变化趋势一致，均呈现先增后降的趋势。所有组在贮藏第2天时PoD活力达到最大值，之后，随着贮藏时间的延长，POD活力开始下降，且冰水+溶菌酶处理组POD活力显著高于CK组(P0.05)这说明在贮藏期间，冰水+溶菌酶、溶菌酶和臭氧水处理都能在一定贮藏时间内提高菠菜POD的活力，延缓其衰老,但冰水和溶菌酶结合保鲜效果最好。3结论本实验以甘肃高原夏菜的代表性蔬菜一一菠菜为材料，研究常温水、lg/1.溶菌酶、2.3mg1.臭
27、氧水及冰水混合物结合溶菌酶4种处理对菠菜贮藏期间品质及硝酸盐含量的影响。结果发现，与其他处理相比，冰水+溶菌酶处理能使菠菜保持较高VC、叶绿素、可溶性蛋白、叶酸含量和可溶性糖质量分数及硝酸还原酶和PoD活力，减缓草酸、硝酸盐、亚硝酸盐的形成，从而可延缓菠菜贮藏期间的衰老，提高菠菜贮藏品质。附参考资料：不同硝酸盐含量菠菜品种的生理差异分析采用营养液栽培方式，以4个硝酸盐含量有显著差异的菠菜品种为材料，测定其生长指标（株高、主根长、株幅、柄长、干鲜重和叶面积）、光合色素（叶绿素a、b及类胡萝卜素）含量、光合作用参数（实际光化学量子产率、表观光合电子传递率、光化学猝灭系数、非光化学猝灭系数）、硝酸根
28、吸收速率和硝酸还原酶活性等，研究不同硝酸盐含量基因型品种的生理差异。结果显示：（1）不同基因型菠菜叶片的硝酸盐含量始终存在着巨大差异，且硝酸盐含量与生物量之间没有明显的相关关系，在同样的栽培条件下，生物量大的品种并不代表其硝酸盐含量低。（2）高硝酸盐含量基因型菠菜品种的光合色素含量较低，光合作用效率较差，硝酸吸收速率较高，硝酸还原酶活性较低；而低硝酸盐含量基因型菠菜品种的光合色素含量较高，光合作用较强，硝酸吸收速率较低，硝酸还原酶活性较高。（3）低硝酸盐含量基因型品种S1.-O6-13的综合评价最好，可以作为选育低硝酸含量菠菜品种的材料。研究表明，菠菜硝酸盐含量的基因型差异产生的原因可能是受硝
29、酸盐吸收和转运的共同影响。现已证实，在玉米、高粱、烟草、大麦及南瓜等植物上存在硝酸盐吸收的基因型差异1。在硝酸盐吸收和转运系统上不同植物体之间存在着差异，它们对硝酸盐有不同的亲和力,高亲和力植物体能在硝酸盐浓度极低（低于ImmO卜1.l）情况下吸收硝酸盐，这些植物能很好地适应硝酸盐低的环境。例如，一般情况下黑麦草生长所需的硝酸盐适宜浓度为1.4mmok1.l,但是当介质中硝酸盐为14UmR1.1.时，它的生长还能达到正常水平的90%2,有些植物体存在着低亲和力的吸收系统，在硝酸盐浓度较高（7Immo卜1.l）情况下还能吸收适量的硝酸盐,Km值在0.5mmol1.-l以上。造成蔬菜体内硝酸盐大量
30、积累的外在原因主要是氮肥的过量施用，其根本原因是硝酸盐吸收和转化的不平衡，然而硝酸盐吸收和同化能力来源于遗传差异。目前对蔬菜不同品种间硝酸盐积累的差异机制一直存在争议,Breimer和Terman认为是由于植株生物量的差异以及生长速率的差异造成的，生物量大植株的硝酸盐含量由于被“稀释而降低；在生物量差异不大的情况下，品种间硝酸盐积累的差异取决于硝酸还原酶的活性3。硝酸还原酶（NR）是一种诱导酶，它的活性大小与植物体内硝酸盐的含量有关。首先，NR的活化需要硝酸盐的诱导，而不同基因型蔬菜植株内的NR受硝酸盐诱导后,其活性的变化速度及变化幅度存在着差异，这也就造成了N03还原程度的差异。其次，NR活
31、性被诱导之后并不是一直保持不变的，而是受自身代谢水平及外界环境条件的调节。一方面，N03的还原需要消耗大后的能量，植株能根据自身代谢的需要、能量及中间物的供应情况来调控NR,从而影响NO3-的还原和含量，不同基因型蔬菜在这一点上的反应不同；另一方面，不同基因型蔬菜的NR在不同环境条件下变化的程度也不同4。正是不同基因型蔬菜在N03-吸收及还原两个方面都存在着差异，才决定了它们在N03含量上的差异5。另外，根系对硝酸盐的吸收量和硝酸盐转运子的表达量的差异也是造成地上部硝酸盐积累差异的一个重要因素6.刀。菠菜作为叶菜类蔬菜中最为常见的一种，其品种间硝酸盐含量差异较大。目前有关菠菜硝酸盐含量的研究已
32、有不少，有关研究都是讨论菠菜在不同供氮水平下对氮素的利用效率等情况，都是选用普通的菠菜品种，而本研究选择硝酸盐含量有显著差异的菠菜品种为材料，在营养液栽培条件下，重点从生理方面探究不同硝酸盐含量品种之间的差异，这将对于探究不同硝酸盐含量品种的生理差异机制提供一定参考。本试验从前期预备试验筛选出的硝酸盐含量差异较大的菠菜基因型中，选择高硝酸盐含量和低硝酸盐含量的代表品种各2个，主要考察不同菠菜品种间生长、叶绿素含量、叶绿素荧光、硝酸盐吸收速率以及硝酸还原酶活性的差异，以期能探明菠菜硝酸盐含量基因型差异的生理机制。1材料与方法1.1 材料与处理根据前期预备试验筛选结果，选择S1.-26-13和波菲
33、特菠菜作为高硝酸含量基因型，S1.-34-13和S1.-06-13作为低硝酸含量基因型进行试验。试验于2014年10月至12月在市农业科学院园艺所人工气候室内进行。试验选用的菠菜种子经消毒、浸种、催芽后播于装有海绵的小蓝盆中，气候室昼/夜温度控制在2325C1618C,空气相对湿度70%,光照3000molm-2s-lo幼苗前期小蓝盆内装清水,2叶1心后装1/2HOagIand营养液，待幼苗4叶1心时，挑选生长一致的幼苗移到装有1/2倍Hoagland营养液的水培箱中pH(6.50.1),EC值为2.22.5mscm-l,每箱定植24株。随机区组排列，3次重复。移苗20d后测量相关生理指标。1
34、.2 测定指标及方法1.2.1 生长指标用直尺测定菠菜株高、主根长、株幅、和柄长；取植株用蒸锵水冲洗、吸干表面水分后，先用电子天平测定植株鲜重，然后105杀青15min,75烘干至恒重，测定植株干重；并且用叶面积扫描仪(EPSonEXPreSSionI680)对菠菜植株基部数第4片真叶进行叶面积扫描，获得叶面积。1.2.2 光合色素含量叶片和叶柄的光合色素含量测定采用王学奎的乙醇提取法8,在665、649和47Onm波长下比色测定相应吸光度值，用相关公式计算叶绿素a、b及类胡萝卜素含量。1.2.3 叶绿素荧光参数叶绿体荧光参数采用PAM-2100便携式荧光仪(德国Walz公司)测定。将菠菜幼苗
35、经过30min充分暗适应，然后照射测量光，得到原初荧光(Fo);随后经过一个饱和脉冲光(3500HmO卜m-2sl,持续0.8S)后关闭，测定暗适应最大荧光(Fm)；以内置光源为光化光(600Umo卜m-2sl)处理菠菜幼苗IOmin后，测得Fm，及Fs；光系统II实际光化学量子产量Yield=(FmFs)F个m、光化学猝灭系数qP=(FnVFs)(FmFo)和非光化学猝灭系数qN=(Fm-Fr)/(Fm-Fo)由仪器自动读数。124硝酸根吸收速率在人工培养箱中设置KN03浓度分别为0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0mmol1.l系列溶液，系
36、列溶液中均含有0.1mmo卜1.lCaS04,以防止单盐毒害。把经过氮饥饿处理的菠菜植株分别称重并记录,做好标记后分别置于50m1.该系列溶液中吸收3h之后，取出。用蒸谯水冲洗植株根部，并与剩余的吸收液合并，稀释定容到100m1.装入小瓶中备用，每个处理均重复3次。记录计算吸收硝态氮的数量，应用酶动力学方程的转换式求出最大吸收速率Vmax和Km值9。125硝酸还原酶活性采用活体法测定10。称取4份Ig植物样品剪碎混匀，剪成ICm左右小段，放于塑料离心管中。其中1份做对照，另外3份做酶活性测定。在对照管预先加入Im1.30%三氯乙酸，然后在各管中都加入9m1.0.1mol1.lKNO3溶液。混匀
37、后立即放入真空干燥培养箱内，抽真空Imirb再通气，反复3次以上以便排出组织间隙的气体，使底物进入组织。最后通入氮气密封后，并在25黑暗中反应0.5h,再分别向测定管加入lm1.30%三氯乙酸，以终止酶反应。吸取2m1.反应液，加入Im1.1%磺胺和Im1.o.02%a-蔡胺(溶解于1.5mol1.lHQ)显色15min后，于4000rminl下离心5min,取上清液于540nm处比色测定其吸光度。1.3 数据处理试验数据采用DUnCan法进行多重比较和统计分析。2结果与分析2.1 不同基因型菠菜硝酸盐含量的差异2015和2016年不同栽培方式下所测得4种菠菜品种叶片的硝酸盐含量结果(表1)显
38、示，在营养液栽培条件下，两年测得高硝酸含量基因型菠菜品种(S1.-26-13和波菲特)的硝酸盐含量均在850mgkg-l以上，而低硝酸含量基因型品种(S1.-34-13和S1.-O6-13)硝酸盐含量均在330mgkg1.以下，高硝酸含量基因型远高于低硝酸含量基因型，如2015年品种S1.261.3是品种S1.34-13的5.2倍，2016年品种波菲特是品种S1.-34-13的7.3倍。在土壤栽培条件下,各品种菠菜硝酸盐含量均比营养液栽培有明显提高,两年测得S1.261.3和波菲特菠菜硝酸盐含量均在1560mgkg-l以上，而S1.-34-13和S1.-06-13硝酸盐含量均在660mgkg-
39、l以下，高、低硝酸含量基因型品种间的差异仍很大，如2015年品种波菲特是品种S1.-34-13的4.8倍，2016年品种波菲特是品种S1.-06-13的6.5倍。以上结果表明2类基因型菠菜叶片的硝酸盐含量虽然均随栽培介质而波动，但不同基因型材料间始终存在着巨大差异，不随环境条件而改变。年份YalrM肿Vahrt)硝酸Ifc含tNitniIrmntl2.4tl4.9aSIO6-13287.25.2b46l.3l7.4cS1.-M-I3245.89.lb599.89.!b表1不同栽培条件下4种菠菜品种叶片硝酸盐含量注：同列不同小写字母表示品种间在0.05水平存在显著性差异；2.2 不同基因型菠菜生
40、长指标的差异表2显示，高硝酸盐含量基因型的2个菠菜品种中，波菲特的株高、根长、柄长、叶面积、株幅分别比S1.2613高出21.54%、34.59%、12.92%、42.78%、34.73%,且除柄长外均达到显著水平；低硝酸盐含量基因型的2个品种中，S1.613的株高、根长、柄长、叶面积分别比S1.341.3高出了20.90%、13.72%、13.80%、33.08%,且除主根长外均达到显著水平，而其株幅比S1.341.3稍低。另外，波菲特菠菜（高硝酸基因型）的上述指标除株幅和叶面积外均显著低于S1.-06-13菠菜（低硝酸基因型）。从表3可以看出，高硝酸盐含量基因型的2个品种中，S1.-26-
41、13菠菜在地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重、地下部干重方面均显著高于波菲特菠菜，增幅分别为39.41%、61.14%、64.94%、25.00%；低硝酸盐含量基因型的2个品种中，S1.-34-13的地上部干鲜重显著高于S1.0613,而其地下部干鲜重稍低于S1.0613另夕卜，S1.-261.3菠菜（高硝酸盐基因型）在上述指标除地上部鲜重外均显著高于2个低硝酸基因型。2.3 不同基因型菠菜叶绿素含量的差异从表4可知，高硝酸盐含量基因型的2个品种中，波菲特菠菜叶片的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量、叶绿素a/b和类胡萝卜素含量均显著高于S1.-26-13菠菜，增幅分别为1238.46%、255.
42、55%、667.74%270.27%、135.00%；波菲特叶柄中上述光合色素指标也不同程度高于S1.2613菠菜，但仅叶绿素a/b达到显著水平，增幅为177.33%。在低硝酸盐含量基因型的2个品种中，S1.06-13叶片的上述光合色素指标均显著高于S1.-3413,增幅分别为118.45%、45.45%、97.28%、51.06%、133.33%,其叶柄的光合色素指标均不同程度地低于S1.-34-13,但差异不显著。另外，S1.-06-13菠菜（低硝酸基因型）叶片的光合色素指标（除叶绿素b外）均显著高于波菲特菠菜（高硝酸基因型）。以上结果说明S1.-06-13菠菜（低硝酸基因型）叶片中叶绿素
43、含量相对较高。品AVariety株高Planthrifhlc*m主根长RckiIlrngfh*mMKSliprImgthZnn计面机4afrram株帐PhnInngr24.670.88r7.970.091I9.47I.I6bI5.971O.44三lS1.al3I8.63O.4730.3321.67u9.O71O.I8a2S.91I.4SI4.431I.Q3be表24个品种菠菜生长状况AAttVarirty地上都斛及ShfMJtffr4util地卜部鲜爪Rm4(mbwti山Jt上辞千里SImxMltyw26d3I6.59O.83a3.4QO.2Ial.272O.O4a0.2010.0la被普特I
44、Mnlr11.900.631)2.ll0.(Mc0.7710.06C0.l60.0lb1,341315.33tO.7Oa2.26tO.I7brI.OSt0.04b0.llt0.0lcS1.al3I3.O9O.3912,72O.21bO.83O.O7cO.I4O.O2br表34个品种菠菜单株生物量状况品冷Vahrty部位Part叶除素aChk)11)4vllamtg,)ltbChlN4yllb/gF1)时用家总量Chloff4vla+b/(11MCf)llal类胡砂PlCCaIotrixtMk/(,)SI26I3叶片BlwlrO.I3O.OId0.!80.0lc0.3110.01d0.740.011O.O4tO.OId叶柄Prtiolc0.050.0l(10.060.0l10.110.01CO.75O.O510.030.0!0.640.0l*2.38O.O312.74O.O410.580.06b口|柄IMioIe0.090.0ld0.050.0ld0.I40.0le2.O8O.22c0.030.0ldSImI3叶片Bb.o.0sc0.440.03bl.470.07c235O.I2brO.33O.O2c叶梅PriiolrO.I21O.O1d0.050.01d0.170.0!de2.4OO.38be0.040.0ld叶片BUIr2.25O.O7.0.640.06.2.91:0.113
