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1、实验一光学显微镜的使用及显微绘图（3课时）实验目的在普通光学显微镜下识别细胞和细胞器的形态结构，掌握生物绘图的方法。实验原理细胞在形态上是多种多样的，有球形、椭圆形、扁平形、立方形、梭形、星形等。虽然细胞的形状各异，但是它们却有共同的基本结构特点，都由细胞膜（动物）、细胞壁（植物）、细胞质和细胞核组成。细胞中的各种细胞器，如线粒体、高尔基体、中心体、核仁、染色体等,一般经过一定固定染色处理后，大多数在光学显微镜下是可以看见的（图1）。细胞器的形态结构在普通光学显微镜下与电子显微镜下所看到的结构有很大的差别。实验仪器、材料和试剂1.仪器：复式显微镜、擦镜纸2.材料：洋葱根尖切片、柿胚乳细胞、小白
2、鼠肝切片、马蛔虫受精卵切片方法与步骤一、洋葱根尖切片细胞的观察先用低倍镜观察根尖的纵切面，注意分生区、伸长区、成熟区细胞的异同，然后再仔细观察细胞的形态结构，特别注意细胞的形状、大小，以及细胞壁、细胞核、核仁、细胞质、液泡的形态结构。观察细胞有丝分裂不同阶段染色体的变化特点。二、柿胚乳细胞示胞间连丝的观察先在低倍镜下找到柿胚乳细胞，然后转用高倍镜观察，可看到细胞间丝状的联系。三、小白鼠肝细胞切片糖原的观察先用低倍镜后用高倍镜观察，可见到许多肝小叶，每小叶有许多紧密排列成索状的多角形的肝细胞，细胞中央有大而圆的细胞核。这时，转用油镜观察，可见到细胞质内分布着许多被染成深色的糖原颗粒。四、马蛔虫受
3、精卵切片中心体的观察取马蛔虫受精卵切片，在显微镜下找到充满子宫腔的受精卵，每个马蛔虫受精卵外围有一层较厚的卵膜，膜内有宽大的围卵腔，各围卵腔内有处在不同分裂期的卵细胞。找到分裂中期的细胞，在细胞中央被染成蓝色条状或棒状的结构，这就是染色体。在染色体两侧可见各有一个较小的，亦被染成蓝色的小粒，称中心粒。在中心粒的周围可见呈放射状的星丝。【作业】1 .画出柿胚乳细胞胞间连丝图，并标示出细胞的各部分。2 .绘制马蛔虫卵细胞中心体图，并标示出细胞的各部分。实验二细胞膜的渗透性观察（3课时）一、实验目的1 .了解细胞膜对物质通透性的一般规律。2 .了解溶血现象及其发生机制。二、实验原理细胞膜是细胞与环境
4、进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细
5、胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。实验用品（一）材料鸡血细胞（二）器材普通显微镜、普通离心机、扭力天平、IOmI试管、IOml刻度离心管、试管架，2ml注射器（无需针头）或5ml移液管、洗耳球、滴管、载玻片、擦镜纸、记号笔等。（三）试剂Alsever溶液葡萄糖2.05g柠檬酸钠（Na9C6H5O7.2H2O）0.89g柠檬酸（C6H6O7.H2O）0.05g氯化钠0.42g蒸馀水100ml调PH至7.2,过滤灭菌或高压灭菌Iomin,置4冰箱保存。1. 0.128mol1.NaCl溶液。2. 0.17mol/1.NaCl溶液。3. 0.17mol1.NaN
6、O3溶液4. 0.17mol/1.NH4Cl溶液。5. 0.17mol/1.NH4AC溶液。6. 0.32mol/1.葡萄糖。7. 0.32mol/1.甘油。8. 0.32mol/1.甲醇。9. 0.32mol/1.乙醇。10.0.32mol/1.丙醇。11.0.32mol/1.戊醇。12.0.32mol/1.丙酮。13.0.32mol/1.尿素。实验步骤：1 .从集市买一只活鸡现杀取血5ml（防止污染），放入盛有20mlAlseveFs液瓶中，混匀后置冰箱保存备用（2周内使用）。2 .使用前，取用AISeVeFS液保存的新鲜鸡血5ml,加入8mlfl0.128mol/1.的NaCI溶液，小心
7、混匀，1000r/min离心5min,如此3次洗涤，最后配成30%的鸡红细胞（CRBC）悬液。3 .取11支试管，按附表中所示测试溶液，分别取样各3ml,作出标记后，各管均加入红细胞悬液2滴，混匀后静置于温室中，观察各支试管中发生溶血的时间及其变化。观察结果：1 .试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（一），镜检红细胞完好呈双凹盘状。2 .如果试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（+或+）,镜检有部分红细胞呈碎片。3 .如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血（+）,镜检发现细胞全部呈碎片。实验建议1 .鸡血在离心时，试管均需在扭力天平上平衡。2 .目测红细胞体积或置于
8、带刻度的离心管中，加入生理盐水配成30%的红细胞悬液；3 .试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。目测法判断标准：快速溶血：+；慢速溶血：+或+；不溶血：一作业：1 .以表格记录各种溶液的溶血现象观察结果2 .就细胞膜对不同物质的渗透性不同，对实验结果进行分析。实验三液泡系、线粒体的超活染色与观察（3课时）实验目的：观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布；学习一些细胞器的超活染色技术。实验原理：活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理
9、、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体内活体染色是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，
10、这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色,理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料,且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来,最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿BOanUSgreenB）和中性红（neutralred）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。詹纳斯绿B专一对线粒体进行染色,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系可以使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。中性红为弱碱性染料，
11、对液泡系的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能与液泡中的某些蛋白质有关。实验仪器设备：显微镜13台，擦镜纸1包，恒温水浴锅2台，Iml移液管26支（或者200U1.移液枪1把，200U1.枪头1盒），刀片26片，锻子26把，牙签1包，载玻片和盖玻片各26片，吸水纸若干。实验试剂：1、Ringer溶液300ml：NaCl2.55g；KCl0.75g；CaC120.09g；蒸储水定容至30Oml2、0.03%中性红溶液100ml：0.03g中性红溶于100mlRinger溶液中，棕色瓶保存3、0.02%詹纳斯绿B溶液100ml：0.02g詹纳斯绿B溶于100
12、mIRinger溶液中，棕色瓶保存实验材料：洋葱鳞茎内表皮细胞，小麦种子或黄豆幼根根尖实验步骤：一、线粒体的超活染色与观察（一）洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色观察1、取清洁载玻片，滴2滴0.02%詹纳斯绿B溶液2、撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，铺展于染液中3、染色10-15分钟，注意不可使染料干燥4、低倍镜检，油镜观察二、液泡系的超活染色与观察1、实验前，把小麦种子或黄豆培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使其发芽到ICm以上2、取清洁载玻片，滴2滴0.03%中性红溶液3、用刀片将出生的幼根根尖切一纵切面，放入染液中4、3染色10-15分钟，注意不可使染料干燥5、吸去染液，滴1滴Ringer液，加上盖
13、片，轻轻敲击，使根尖压扁6、低倍镜检，油镜观察实验四叶绿体分离与叶绿素自发荧光的观察（3学时）叶绿体足植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。实验目的1 .通过植物细胞叶绿体的分离。了解细胞器分离的一般原理和方法。2 .观察叶绿体的自发荧光和次生荧光.井熟悉荧光显微镜的使用方法。实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以
14、及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol1.氯化钠或0.4moJ1.蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在100Ormin的条件下离心2min,以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000rmin的条件下离心5mia,即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在05C的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。荧光显微术是利用荧
15、光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荣光.若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿索的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附口丫咤橙后可发桔红色荧光。利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必
16、要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片，益玻片和无荧光油。实验仪器设备一、器材1、主要设备：普通离心机、组织捣碎机，粗天平、荧光显微镜。2、小型器材，50Oml烧杯2个,25OmI量筒1个,滴管10支，1Oml刻度离心管20支,纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。实验材料新鲜菠菜。实验试剂0.35mol1.氯化钠溶0.01%口丫咤橙(acridineorange)。实验方法1、选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于15OmK).35mol1.NaCI溶液中，装入组织捣碎机。2、利用组织捣碎机低速(5000rmin)匀浆35mino3、将匀浆用6层纱布过滤于
17、50OmI烧杯中。4、取滤液4ml在100Ormin下离心2min。弃去沉淀。5、将上沾液在3000rmin下离心5rmin.弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞咳)。6、将沉淀用0.35mol/1.NaCl溶液悬浮。7、取叶绿体悬液一消滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。在普通光镜下观察。在荧光显微镜下观察。取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再漓加一滴0.01%口丫咤橙荧光染料，加无荧光盖片后即可以荧光显微镜下观察。菠菜叶手切片观察用剖须刀将新鲜的嫩菠菜切削一斜而置于载片上，滴加1-2滴0.35mol/1.NaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。在普通光镜下观察。在
18、荧光显微镜下观察。用同样方法制片，但滴加I-2滴0.01%QY咤橙染液染色Imin,洗去余液，加盖井后即町以荧光显微镜下观察。实验结果一、叶绿体的分离和观察1、普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。2以C)IymPUS荧光显微镜为例，在选用B(blue)激发滤片,B双色镜和0530(Orange)阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。3、加入口丫咤橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧色。实验五FeIIlgen反应显示细胞内DNA的分布(3课时)实验目的：了解FeUIgen反应的基本原理，熟悉SChiff试剂的配
19、制方法,要求学生掌握Feulgen反应制作细胞DNA定性、定量测量样品的基本方法。实验原理：DNA经弱酸水解后其上的喋吟碱基和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与SChiff试剂反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醒基，醍基是一个发色团，所以具有颜色。实验仪器设备：组织捣碎机1台、托盘天平13台、普通低速离心机4台、普通显微镜13台，擦镜纸1包，剪刀26把，IOml移液管26支，IOml离心管26支，研钵26个(或者匀浆器26个)，载玻片和盖玻片各26片，纱布若干。实验试剂：1、CarnO
20、y固定液50ml：95%乙醇：冰醋酸=3:12、ImOl/1.盐酸溶液100ml：取比重1.18的浓盐酸82.5ml,加水稀释至100ml3、SChiff试剂22OmI先将200ml蒸僧水煮沸，由火上取下，加入碱性品红1g,充分搅拌助溶。待溶液冷却到50时,过滤到磨口棕色试剂瓶中。加入1mol/1.HC1.20ml,冷却到25时加入1g偏重亚硫酸钾(K2S2O5)或偏重亚硫酸钠(NaS2O5)充分振荡后盖紧瓶塞，放于暗处过夜。次日取出，呈淡黄色或近于无色，加中性活性炭一匙，约0.5g,剧烈振荡1min,过滤后即得无色品红。无色品红配成后续塞紧瓶塞，外包黑布或黑纸，储存在冰箱或黑暗低温处。4、亚
21、硫酸水溶液(漂白液)110ml10%偏重亚硫酸钾水溶液5ml,蒸谯水100ml,1mol/1.HCl5ml,摇匀，塞紧瓶塞。此溶液在使用前配制，否则会因SO?的逸出而失效。5、5%三氯醋酸50InI6、0.5%固绿酒精溶液50ml：用95%酒精溶解实验材料：大麦或小麦种子，洋葱实验步骤：1、实验准备：待大麦、小麦或洋葱根长至l2cm时，切取0.5Cm长的根尖部分。2、实验步骤Carnoy固定剂固定10-30分钟I压片I蒸饵水一(对照)5%三氯醋酸，90,15分钟I70%酒精I实验组一蒸锵水lmol1.HCl608-15分钟ISChiff试剂60-90分钟I亚硫酸水(1,2,3)换3次,每次5分
22、钟I自来水洗I蒸锵水I0.5%固绿水溶液(复染)1分钟I蒸锵水I镜检做Feulgen反应时,应注意的几个问题固定剂的选择:一般常选用Carnoy固定液.其他的固定剂如Flemming固定剂及Champy固定剂等均可用，但不能使用Bouin固定剂.水解时间：水解时间一定要合适,不宜过长或不足,否则会影响实验结果.如用Carnoy固定液固定的材料,水解时间一般在8-15分钟之间.水解时间的长短要随不同的材料及不同的固定剂而定.Schiff试剂的质量:在做Feulgen反应时,重要的因素就是Schiff试剂的质量问题.实验时,要注意试剂颜色是否正常,有无SO/的气味.洗涤剂的重要性:漂洗时所用的亚硫
23、酸水，最好在每次实验前临时配制，以便保持较浓的SO2.实验对照组:一定要做对照片，以便说明实验结果的真实性.操作过程中,用锻子锻取根尖的伸长区部位,切勿夹取根冠部位.压片过程中尽量使根尖分生组织细胞保持原来的分布状态.作业：绘图表示DNA在细胞中的分布情况；在实验过程中，酸水解起到了什么样的作用？实验六植物根尖细胞有丝分裂的观察（3课时）实验目的：掌握细胞有丝分裂制片的基本方法，熟悉各期细胞的特点。实验仪器:显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、滴瓶实验试剂：1、CamOy固定液迎血：95%乙醇：冰醋酸=3:12、醋酸洋红染色液100ml：将洋红粉末Ig倒入100m1.45%醋酸溶液中，边煮边搅拌,
24、煮沸（沸腾时间不超过30s）,冷却后过滤，即可使用。3、甲醇，香柏油，二甲苯实验材料：洋葱实验步骤：1、洋葱根尖的培养：实验前三、四天开始准备。将洋葱放置在温暖处，经常换水，使洋葱的底部总是接触到水。根长出12厘米时，即可供实验用。2、装片的制作：取材:切取根尖23毫米,在根尖分裂最旺盛时（上午11点左右）做实验为好,（或在夜间01点）取材固定（固定液用一份冰醋酸与三份95%酒精配制）备用。（2）解离：用10%盐酸，室温下解离10-15分钟（时间过短，则细胞不易压散，时间过长,则细胞容易被压碎，影响染色），使细胞相互分离。材料白色微透明，以解剖针能轻轻压碎为好。（3）漂洗：清水漂洗约10分钟，
25、目的是洗去材料中的盐酸，以利于染色。（4）染色：主要是使染色体着色。所以要用碱性染料（如0.01gm1.龙胆紫溶液或醋酸洋红液等）染色35分钟。（5）装片：装片时，不能使盖玻片移动，以免使材料模糊不清。并用手指轻轻压挤，以使细胞分散开。3 .观察：先在低倍镜下找到排紧密，呈正方形细胞，再注意寻找正在分裂的细胞，移至视野中央；然后换高倍镜用细准焦螺旋把视野调整清晰，细心观察。特别注意观察各时期细胞内染色体的变化。细胞分裂各期常在几个视野中才能找全。作业：1、有丝分裂的过程2、有丝分裂过程中染色体形态的特征实验七考马亮蓝R250染色法观察微丝(3课时)实验目的：掌握考马斯亮蓝R250染微丝的染色方
26、法；观察光镜下微丝的基本形态和结构。实验原理：细胞骨架(CytoSkeEon),是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。实验器材：光学显微镜、温箱、细胞培养设备、染缸、载玻片、盖玻片、滤纸、剪刀、镶子。实验试剂：1、pH7.4PBS
27、2、M-缓冲液咪唾KClMgCl26H2OEGTAEDTA2H2OP-筑基乙醇甘油(PH7.2)：3.04g3.73g0.10g0.38g0.04g70l294.8ml蒸储水定容至I1.,IM盐酸调pH7.21%TritonX-100：M-缓冲液配制4、0.2M磷酸盐缓冲液(pH6.8)：Na2HPO42H2O0.8725gNaH2PO4H2O0.7038g蒸馄水定容至50ml5、0.2%考马斯亮蓝R250：甲醇46.5ml冰醋酸7.0ml蒸馄水46.5ml考马斯亮蓝R2500.2g6、0.3%戊二醛：用0.2M磷酸盐缓冲液配制实验材料：洋葱实验步骤：1、取洋葱鳞茎表皮，放入0.2M磷酸盐缓冲
28、液(pH6.8)中2、1%TritonX-100处理洋葱表皮20-3Omin3、M-缓冲液洗涤3次，每次IOmin4、加0.3%戊二醛固定0.5-1h5、PBS洗3遍6、0.2%考马斯亮蓝R250染色30min7、蒸储水洗，镜检。作业：1、画出实验所观察到的细胞骨架图，并注明放大倍数。2、为什么用TritonXJ(M)的缓冲液处理材料？实验八细胞凝集反应及细胞吞噬（3课时）实验目的：了解细胞凝集和细胞吞噬的原理，掌握细胞凝集和吞噬实验技术。实验原理：细胞质膜外的粘性多糖与凝集素特异性识别，结合在细胞间形成桥，引起细胞凝集，加入与凝集素互补的糖可抑制细胞凝集。实验需要的仪器、设备：显微镜、手术器
29、械、注射器、载玻片、盖玻片、吸管、滴管实验需要的试剂：1、0.85%生理盐水2、阿氏（AISeVer）血液保存液葡萄糖2.05g柠檬酸钠（Na9C6H507.2H20）0.89g柠檬酸（C6H607.H20）0.05g氯化钠0.42g蒸偏水100mI调PH至7.2,过滤灭菌或高压灭菌Iomin,置4冰箱保存。3、可溶性淀粉：6.Og加水100lnI煮沸备用4、基姆萨染色液5、PBS6、肝素（或柠檬酸钠）实验需要的生物材料：土豆、小白鼠，鸡红细胞实验步骤：一、细胞凝集1、制备2%鸡红血细胞悬液2、称取土豆去皮块茎2g,加IOnllPBS缓液，漫泡2h,浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集索。3、用滴
30、管吸取土豆凝集素和2%红细胞液各一滴，置载玻片上，充分混匀，静置20min后于低倍显微镜下观察血球凝集现象。4、以PBS液加2%血细胞液作对照实验。二、细胞吞噬实验原理：高等动物的巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等具百噬作用。当病原微生物或其它异物侵入机体时，吞噬细胞具有趋化性，可向异物聚集，把异物吞入形成百噬泡，与胞内溶酶体融合,把异物消化分解。1、鸡翼下静脉取血后，加生理盐水离心两次，然后根据获得的红细胞的体积加入适量的生理盐水，调至鸡红细胞浓度为1%。2、实验前三天，每天向小鼠腹腔注射ImI可溶性淀粉，实验前30分钟，向腹腔内注射ImI1%的鸡红细胞。3、在干净的载玻片上滴加一滴生理盐水，
31、向其中滴加一滴腹腔液，静置10分钟，使腹水细胞贴壁，弃去生理盐水，待其稍干后，进行瑞氏染色。4、镜检作业：1、绘图表示镜检时你所能看到的各种细胞类型及其形态2、哪些因素影响细胞的凝集反应？3、描述小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的乔噬过程4、分析吞噬的保护作用实验九细胞融合(3课时)实验目的：学习细胞融合及其应用的有关知识，初步掌握动物细胞PEG融合的方法。实验原理：2个或2个以上的细胞合并为1个细胞的现象，称为细胞融合。细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合方法。用PEG处理细胞，能使质膜性质发生改变，导致细胞膜融汇，胞质流通，最后导致细胞融合。实验仪器：光学显微镜，离心机，恒温
32、水浴锅，CO2培养箱，超净台，倒置显微镜，无菌注射器，6号针头，刻度离心管，试管，载玻片，盖玻片。实验试剂：1、50%PEG2、Hanks液(CaCI2；KCl；KH2PO4；MgCl2.6H2O；MgSO4VH2O；NaCl;NaHCO3；Na2HPO4-12H2O;Na2HPO4-VH2O;D-葡萄糖；酚红)3、GiemSa染液(GiemSa粉末，PBS,甘油)4、甲醇，碘酒，75%乙醇实验需要的生物材料：鸡红细胞实验步骤(1)取新鲜鸡血以0.85%生理盐水制成10%的悬液。(2)称取0.5克PEG(MW=4,(XX)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀制
33、成50%的PEG溶液。放入37水浴中待用。(3)取上述10%的鸡红细胞悬液ImI放入离心管中，再加入5mlHanks液混匀，然后以1,00OrPm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。(4)取上述50%PEG溶液0.5ml,在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后静置1分钟左右。此全部过程都要求在37C水浴内进行。(5)缓慢滴加9mlHanks液以终止PEG的作用，在37水浴内静置5分钟。(6)离心弃上清后，取一滴融合后的细胞悬液滴片，加盖片镜检。作业：1 .绘制你所观察到的融合细胞。2 .请你写出细胞融合注意事项实验十细胞死活鉴定(3学时)一、目的和要
34、求学习掌握植物细胞染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法。二、实验原理活细胞和死亡细胞在生理机能和性质上主要存在以下差异：细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台吩蓝、伊红、苯胺黑、赤薛红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙咤或澳化乙咤等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。细胞死活的鉴定方法有很
35、多种，染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞，细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。用某种对植物无害的染料稀溶液对活细胞进行染色称活体染色。中性红是常用的活体燃料之一。在中性或微碱性环境下，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡排泄，液泡一般
36、呈酸性，进入液泡的中性红解离出大量阳离子而呈樱桃红色，原生质及壁不染色。死细胞的液泡已消失因而不产生液泡着色现象，中性红阳离子却与带一定负电荷的原生质及细胞核结合而使原生质及细胞核染色。死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择透性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过;而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。成长的细胞是一个渗透系统，活的原生质具有选择透性，原生质内部包含着一个大液泡，具有一定的溶质势。当细胞与外界低水势溶液接触时，细胞内的水分外渗.原生质随着液泡一起收缩而发生质壁分离；其后，当与清水(或高水势溶液)接触，细胞又因液泡的吸水膨胀而发生质壁分离复原。死细胞
37、因其原生质的选择透性己遭破坏，故与低水势溶液接触时不产生质壁分离。【实验材料】1 .试剂：75%酒精、PBS液、细胞培养液、台盼蓝。2 .器具：超净工作台、解剖盘、锻子、剪刀、吸管、移液枪、玻璃培养皿、塑料培养InI、“1.型针头注射器、火柴、酒精棉球、酒精灯、Eppendorf管、离心机、二氧化碳培养箱、记号笔、倒置显微镜、血细胞计数板、盖玻片、普通光学显微镜、玻璃离心管，等。3 .材料：小白鼠染色法鉴定细胞死活及活细胞计数1 .试剂配制：用生理盐水配制0.4%台盼蓝染液，备用。2 .细胞生长状态观察：从培养箱中取出培养物，观察培养液的颜色。然后将培养皿置于倒置相差显微镜观察细胞生长状况。3
38、 .细胞悬液制备：取0.5m1.细胞悬浊液于试管（本实验中，用玻璃离心管代替）中，加12滴台盼蓝染液（约0.1ml）,混合均匀，染色2min。4 .细胞计数：滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，细胞悬液依毛细作用扩散到计数区，使悬液自然充满计数板小室（注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加）。在普通光镜IOX物镜下找到中心处的大方格，改用40X物镜，取中间和四个角上的中等方格，计数每个方格内死活细胞的数量（注意：当遇到位于大格线上的细胞，一般数上不数下，数左不数右）。先计数总细胞，再计数死细胞（蓝色）。5 .根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：细胞总数-死细胞数活细胞率（）二100%细胞总数【思考题】1 .为什么要学习细胞生死状态鉴别的方法？试说明其实际应用意义。答：在细胞培养的实验室操作以及制造生物制剂时，有时需要确定某舟细胞的生存状态，以便进行下一步操作，因此选择恰当的细胞生死状态鉴别的方法是十分重要的。2 .各种细胞生死状态方法的原理和判定特征是什么？3 .活细胞、坏死细胞和凋亡细胞的形态特征是什么？它们的主要区别有哪些？实验十一细胞内组分的特异性显示和定性定量分析（6学时）
