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1、sars-covs240蛋白与眼部ace2受体作用机制的探讨SAKS-CoVS240蛋白与眼部ACE2受体作用机制的探讨【摘要】目的：探讨SAKS冠状病毒(SARS-CoV)S240蛋白与眼部功能性受体一血管惊慌素转化所2(ACE2)作用的机制。方法：构建SARS-CoVS蛋白融合基因pS240-EGFP,并在哺乳动物细胞中表达；半定量RT-BCR和免疫组化鉴定CE2在结膜、角膜中的表达；陶联免疫吸附试验、流式细胞仪检测法进行SARS-CoVS240蛋白与结膜、角膜细胞的体外结合探讨。结果：构建/融合基因pS240-EGFP:证明ACE2在结膜、角膜有表达;结膜、角膜细胞与SARS-CoVS2
2、40蛋白能够结合。结论：结膜、角膜中存在SARS冠状病毒的功能性受体，SARS-CoVS240蛋白与结膜、角膜细胞能够结合。本探讨对了解SARS的病理机制及进一步探讨SARS的防护和治疗具有肯定的参考意义。【关键词】严峻急性呼吸综合征冠状病毒S240蛋白受体血管惊慌素转化的2结合作用O引言非典型肺炎即严峻急性呼吸综合征(SeVereacuterespiratorysyndrome,SARS)具有高度传染性与致病性，其致病因子为一种新型冠状病毒一SARS冠状病毒(SARS-CoV),基因组结构为：5-帽状结构-复制酶(rep)-棘突糖蛋白(三)-小包膜蛋白(E)-膜糖蛋白(M)-核衣壳蛋白(N)
3、一多聚核甘酸(polyA)尾-30S蛋白介导了病毒与宿主细胞的结合，SARS-CoV的功能性受体是血管惊慌素转化的2(angiOlensin-Convcrtingenzyme2-CE2)。本探讨用293T细胞表达出了包含SARS-CoVS蛋白结合功能区域的pS240-EGFP融合蛋白片段，体外培育了人结膜、角膜细胞,检测了SARSYoV的功能性受体ACE2在人结膜、角膜中的表达，并进行了非洲绿猴肾细胞(VeroE6Cell)、人结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞和角膜上皮细胞与SARS-CoVS240-EGFP融合蛋白片段的体外结合试验探讨。1材料和方法1.1材料SARS-CoVS(基因组原型Gen
4、Bank登录号为：AY278554)基因片段S1(1-1650nt)DNA片段。ACE2引物序列(accessionnumberF291820)：上游引物5-CAnGGAGCAAGTGTrGGATCTT-3,下游引物5-GGCTTGCTGCC11CTC-3,扩增片段长度为107个碱基。GAPDH：上游引物5-tgggctacctgagcaccag-3,下游引物5-GTGGTCGTTGGGGCAT-3，扩增片段长度为100个碱基。由上海博亚生物工程公司合成。PCR产物克隆载体PVD-18T（TaKaRa公司）：质粒PEGFP-（Clontech公司）；脂质体转染试剂1.ipofectamineT
5、MRcagent（Invitrogen公司）；MammalianProteinExtractionReagent哺乳动物细胞蛋白抽提液（PlERCE公司）：SABC-AP免疫组化染色试剂盒（Santa-Cruz公司）：SARS患者复原期血清（运用前经56C加热30min进行灭活，获自北京小汤山医院与解放军309医院】主要抗体：角蛋白KeratinPan,波形蛋白Vimentin,神经纤维丝蛋白NFkappaB（上海友情中联生物工程有限公司）：抗鼠辣根标记的二抗（上海华美生物工程有限公司）：羊抗人ACE2多克隆抗体（RD公司）。组织来源：36m。中期引产胎儿的角膜、结膜、心、肺组织，男女不限；成
6、人眼球裂开伤摘除的角膜和结膜组织：尸体解剖的成人心、肺、脑组织由长海医院供应。1.2方法1.2.1pEGFP-Nl及pS240-EGFP融合蛋臼的表达PCR引物：SRF：5,-gttcgcccctgcgcctctatttcgggttg-3（斜体为EcoRI的切位点）：SRR:5,-TCTG11GGGATCCTCTCGGGGGTTCCCCAGTC-3（斜体分别为XbaI、BamlIhXhollw切位点）。基因工程方法构建真核表达质粒pMD-S240,进一步构建pS240-EGFP融合蛋白表达质粒。利用脂质体介导转染法将PEGFP-N1、pS240-EGFP分别转染293T细胞并进行克隆培育；细胞
7、蛋白抽提液裂解细胞并进行透析，荧光分光光度计检测透析前后荧光光度值：Braford法检测蛋白质浓度；WesternBlot法分析基因表达产物。1. 2.2CE2在人结膜、角膜的表达体外培育人结膜上皮细胞、角膜上皮细胞、结膜成纤维细胞并行EIJSA法鉴定。抽提组织（或细胞）的总RNA,鉴定RNA纯度、浓度和完整性；半定量RT-PCR；琼脂糖凝胶电泳；经熨日紫外及可见图像识别分析系统（上海复口科技公司）进行电泳条带光密度扫描，以光密度积分值比值ACE2GPf）H代表mRNA的表达水平，试验重复3次，数据运用SS软件包处理。免疫组化法检测组织、细胞中ACE2的表达（SABC法1.2. 3S240-E
8、GFP蛋白与各组织、细胞的结合免疫酶标技术E1.ISA法：透析的各种组织及细胞蛋白抽提液与S240-EGFP蛋白进行结合试验，分别运用脑组织和Hela细胞及EGFP蛋臼作为阴性比照，运用ACE2抗体进行阻滞探讨。对所得的A450值进行统计分析，运用SAS软件包，采纳析因方差分析。流式细胞仪及荧光显微镜检测细胞与S蛋白的结合:检测结合后的荧光细胞。2结果2.1pEGFP-Nl及pS240-EGFP融合蛋白的表达质粒琼脂糖凝胶电泳（图1）与DNA测序鉴定证明SARS-CoVS240-EGFP融合基因构建正确。转染的293T细胞在4-IOh内视察到绿色荧光，12h后可视察到明显荧光。其中pEGFP-
9、Nl转染细胞的荧光较pS240-EGFP转染细胞的荧光稍强，细胞形态呈圆形（图2）0SARS-CoVpS240-EGP基因表达产物的SDS-PAGE及WesternBlot分析：相应分子质量处出现蛋白表达条带，与理论推算值相符。2.2ACE2在人结膜、角膜的表达培育的人结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞和角膜上皮细胞（图3）,E1.ISA法鉴定细胞属性正确。抽取总RNA样品的浓度在0.12-0.5g1.之间、完整性良好、A260/280比值为1.82.0之间的抽提样本，进行RT-PCRe半定量统计结果认为成人肺组织、成人心组织、成人结膜组织与成人角膜组织间及Vero细胞、结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞
10、与角膜上皮细胞间ACE2-与GPDH-的比值间的差异有统计学意义；ICVenC法进行组间两两比较结果除了结膜上皮细胞与角膜上皮细胞间无显著差异外，其他各组织、细胞间均有显著差异（图4)免疫组化法检测组织、细胞中CE2的表达结果见文献1。2.3S240-EGFP蛋白与各组织、细胞的结合免疫的标技术E1.IS法：细胞及组织蛋白抽提液浓度为10mg1.时，结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、结膜、角膜组织的蛋白抽提液与pS240-EGFP蛋白出现了比较明显的阳性结合反应，与VeroE6细胞及心、肺组织蛋白抽提液相比稍弱；He1.a细胞和脑组织蛋白抽提液与pS240-EGFP蛋臼均没有出现阳性
11、结合反应。相同浓度的上述组织、细胞蛋白抽提液中分别加入PEGFP-Nl蛋白，均没有出现阳性结合反应。空白比照组为阴性反应。相同浓度的VCroE6细胞、结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、心、肺、结膜、角膜组织蛋白抽提液被ACE2抗体孵育后，与pS240-EGFP蛋臼没有出现阳性结合反应（图5）。用析因方差分析比较S240和EGFP在不同浓度（Img/1.和10mg1.）下与结膜上皮细胞、Ver。、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、He1.a的结合实力，结果显示：S240-EGFP的结合实力比EGFP强，均数分别为0.2676,0.0092,10mg1.浓度比lmg1.浓度结合实力强，均数分
12、别为0.2663,0.0105o在比较的各种细胞中，Vero的结合实力最强，均数为0.2661,结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、结膜上皮细胞的结合实力相当，均数分别为：0.1393,0.1392,0.1377,He1.a的结合实力最差，均数为0.Olo经过比较，以10mg1.浓度的S240与Vero的结合实力最强,均数标准差为1.03190.0072用同样的方法比较S240和EGFP在不同浓度（lmg1.和10mg1.）下与心、肺、结膜、角膜、脑5种组织的结合实力，结果如下：S240的结合实力比EGFP强，均数分别为0.3190,0.0071,10mg1.浓度比lmg1.浓度结合实力强，均数分别
13、为0.3177,0.0084o在比较的各种组织中，心、肺组织的结合实力最强（二者无差异），均数分别为0.2653,0.2648,结膜组织和角膜组织的结合实力为其次（二者无差异）,均数分别为：0.1395,0.1389,脑组织的结合实力最差，均数为0.0067o经过比较，以10mg1.浓度的S240与肺组织、心组织的结合实力最强，均数标准差分别为1.03660.0070,1.03650.0060=流式细胞仪检测结果显示：从细胞荧光指数视察，VeroE6细胞、结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞与PEGFP-Nl蛋白均没有明显的结合；VeroE6细胞与pS240-EGFP蛋白出现了较明显的结
14、合，结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞与pS240-EGFP蛋白也表现出肯定的结合，但较VeroE6细胞明显要弱：上述细胞预先被ACE2抗体孵育后，与pS24O-EGFP蛋白的结合明显被阻滞；而ACE2同种异型抗体没有能够阻滞上述细胞与pS240-EGFP蛋白的结合（图6）。3探讨呼吸道病毒能够侵扰眼部，引起眼部的感染，如病毒性结膜炎和角膜炎等，WHO把泪液作为可能藏有SARSYOV的体液之一。许多医务工作者如眼科医生与患者的眼部近距离接触，可能形成SARS-CoV在医务工作者和患者之间的传播。还有可能通过应用眼部检查设备，造成病毒在患者之间的传播。因为SARSYOV的高传染性和高致病
15、性，目前大多数有关SARSYoV的探讨无法运用真正的活病毒来进行，背而代之的是构建SARSYOV的结构或功能蛋白，从蛋白质水平进行相关的探讨。SARS-CoVS蛋白属于I型膜蛋白，为1255个城基酸残基组成的病毒表面突起触蛋白前体，以三聚体形式存在，是构成病毒表面冠状结构的主要成分，也是病毒和宿主细胞受体结合及病毒诱发机体产生抗体或细胞性免疫反应的重要因子，S蛋白识别和结合宿主细胞上的受体主要借助于其N端的Sl片段2,30Wong等4探讨显示在S318-510之间集中了SARS-COVS蛋白受体结合区域，比全长Sl蛋白具有更好的可溶性和折登性，能更有效地结合CE2及阻滞S蛋白介导的病毒与细胞之
16、间的结合。1.i等5,Xiao等6,Wong等4,已经利用人肾细胞株293或293T细胞表达了重组的全长S蛋白或S蛋白片段，并将其应用于SARS-CoVS蛋白的结合探讨。这里，我们胜利构建了包含SARS-CoVS蛋白结合功能单位的S240-EGFP融合蛋白，并将其在293T细胞中进行了表达。通过克隆培育转染阳性的细胞，提高了融合蛋白的得率，同时也提高了细胞蛋臼抽提液中口的蛋臼的浓度，为开展SARS-CoV眼部入侵途径的探讨建立了初步的技术平台。SARS是一种高度传染性的疾病，主要是通过空气中的飞沫传播和粪便传播，侵扰下呼吸道，进一步导致肺损害和呼吸窘迫7,除此之外的传播途径目前还不清晰，尚没有
17、临床资料发觉SARS患者有角膜、结膜感染的眼部并发症出现。人类组织中ACE2表达的定位论证可以间接地推断SARS-CoV的感染途径和可能的体内传播和复制路途，实时定量PCR8-12及免疫组化探讨表明13ACE2在人肺和小肠上皮细胞中大量表达，提示SARS-CoV入侵可能途径为呼吸道和胃肠道。本探讨用半定量RT-PCR和免疫组化的方法鉴定了ACE2在人结膜和角膜组织中的表达及不同组织间表达的差异，证明人角膜和结膜组织及人结膜上皮细胞、角膜上皮细胞和结膜成纤维细胞中存在ACE2的表达，但表达量较人心、肺组织和VerOE6细胞要少。探讨表明3,5,14-18,ACE2的表达量的多少与细胞与SARS-
18、CoVS蛋白的结合实力有肯定关系，而细胞结合探讨中人结膜上皮细胞、角膜上皮细胞和结膜成纤维细胞与SARS-CoVS蛋臼结合的实力与VeroE6相比明显要弱，这一结果与半定量RT-PCR的探讨结果相符。分析缘由可能还有：结膜和角膜细胞中ACE2的表达主要位于胞浆，细胞膜上表达较少，无法充分发挥受体的功能；我们构建的pS240-EGFP蛋白片段是通过转染的细胞裂解、抽提蛋白质而得到的，蛋白片段较大，而且没有进行蛋白质纯化，肯定程度上影响了其与CE2受体的结合；已经有一些探讨证明13,19-21,虽然有些细胞和组织含有CE2的表达，但是并没有发觉这些细胞和组织中有SARS病毒的熨制和基因表达，其中的
19、原理尚不非常明确，可能与病毒入侵这些组织和细胞须要某些协助因子或复合受体有关：虽然新加坡22的探讨人员已经发觉SARS患者的泪液中存在SARS-CoV,但目前尚没有临床资料证明SARS患者出现病毒性结膜炎和角膜炎的并发症，这些与我们的探讨结果有某些相像。当然，假如能够利用非洲绿假等SARS-CoV易感动物进行SARS-CoVS蛋白的在体结合探讨甚至进行SARS-CoV活病毒的在体探讨则能更加确凿地得到SARS-CoV眼部亲嗜性的证据。【参考文献】1孙琰，潘欣，柳林，倪灿荣SARS-CoVS蛋白功能性受体ACE2在人、兔角膜、结膜中的表达.眼科新进展,2004:24:232-2362WangP,
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