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1、PBOO对豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞形态结构的影响【临床医学毕业论文范文doc格式下载】.DOC临床医学论文-PBOo对豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞形态结构的影响作者：王永权，方强，路扬，李龙坤，宋波【摘要】目的探讨豚鼠膀胱流出道梗阻(PBOO)对膀胱K哈尔间质细胞(IeC)形态结构的影响。方法建立雌性豚鼠PBOO模型，芥依据尿动力学检测结果将模型分为PBOO后遇尿肌不稳定(DO)组和PBOO后退尿肌稔定(DS)组，以假手术组作为比照，饲养4周后取膀胱组织，制成全层组织铺片和冰冻组织切片，Ckit免疫荧光染色分别视察各组膀胱肌层和黏膜FICC的形态和分布状况。结果PBOo4周后，DO组豚鼠膀胱出现排尿频
2、率、排尿压力的增加(n=12,PO.05),并且视察到明显的储尿期膀胱不稳定收缩。比照组、DS组和DO组豚鼠膀胱均视察到ckit染色阳性且呈典型长枚形有突起的ICC.主要分布于平滑肌肌束间和黏膜下层：在DO组豚鼠的膀胱中Ckit染色阳性的ICC分支突起增加且相互连接呈网络状，而在比照组和DS组中ICC呈散在分布，细胞之间联系较松散。结论在PBOO所致DO豚鼠膀胱中ICC发生形态和结构的变更，相互之间连接呈网络状，ICC的形态和结构的变更可能是逼尿肌不稳定的重要发病基础。【关键词】卡哈尔间质细胞；逼尿肌不稳定：膀胱流出道梗阻；膝胱Abstract：ObjectiveToinvestigateth
3、ealteredmorphologycharactersofinterstitialcellsofCajalcells(ICC)inguineapigbladderafterpartialbladderoutletobstruction(PBOO).MethodsPartialbladderoutletobstruction(PBOO)animalmodelswereproducedinfemaleguineapigsandwerevalidatedwithUrodynamicexamination.AnimalswithunstablebladderpressureafterPBOOwere
4、setasDOgroup.AnimalswithstablebladderpressureafterPBOOweresetasdetrusorstable(DS)groupandcontrolgroupwascomposedbyshamoperatedanimals.ImmunohistochemistrystudiesforCkitasaspecificmarkforICCwereperformedonguineapigbladdersineachgroup.ResultsFourweeksaftersurgery,animalsinDOgroupshowedanincreasedvoidi
5、ngfrequency,highervoidingpressureandirrcgularnonvoidingcontractions(n=12,PO.05).WefoundincreasingmutualconnectionandmultilayerconstructioninsuburotheliumandintermuscularlayersofDObutnotDSandcontrolbladders.ConclusionThosefindingsdemonstratedthemorphologicalandstructuredifferencesofICCinguineapigblad
6、derafterPBOO,whichsuggestICCbeinvolvedintheetiopathogenesisofDO.Keywords：cajalinterstitialcells：detrusoroveractivity;partialbladderoutletobstruction;bladder膀胱逼尿肌的兴奋和收缩可受神经、体液等多种因素的调控和影响。目前的探讨表明，膝胱平滑肌的兴奋调控可能与一种特别的间质细胞,卡哈尔间质细胞(interstitialcellsofCajal,ICC)有关1。ICC首先在胃肠道组织中发觉，其细胞膜上带有特异性的ckit受体酪宏酸激的的表面标记
7、。ICC对胃肠道基本电节却的形成、神经传导的调控、信号整合等多种生理功能起到r重要的作用20目前，在胃肠道组织以外的多种平滑肌组织(如输尿管、膀胱、子宫、胆囊等)接连发觉rICC的存在34,但是胃肠道外ICC的功能学探讨尚处于起步阶段。逼尿肌不稳定(DetrusorOveractivityDO)是常见的膀胱功能障碍，临床上常表现为一种以尿急症状为特征的征候群，常伴有尿频和夜尿症状，可伴或不伴有急迫性尿失禁；尿动力学上可表现为膀胱储尿期的膀胱不稳定收缩。依据2002年国际尿控协会的定义，DO在尿动力学的描述中为充盈期出现无意识的逼尿肌自发或经诱发的收缩5。DO常伴发于膀胱流出道梗阻的患者。然而相
8、当一部分患者在机械梗阻病因解除后排尿功能障碍并未得到有效缓解，提示逼尿肌不稳定的发病机制还有待进一步探讨。既往的很多探讨中关于神经调控异样和逼尿肌自身的结构变更等假说也不能满足的说明DO的发病缘由6,而ICC在膀胱中的发觉和初步探讨表明，膀胱ICC在调整膀胱的局部收缩和逼尿肌自发性兴奋中可发挥重要的作用，因此，基于膝胱ICC的相关探讨可能是对DO等膀胱功能障碍性疾病发病机制的重要补充。本探讨建立脐胱流出道部分梗阻（Patialbladderoutletobstruction,PBOO）致Do模型，通过免疫荧光标记的方法，比较ICC在PBOO膀胱中形态结构的差异，为进一步相识DO的发病机制打下肯
9、定基础。1材料与方法1.1主要材料与试剂健康雌性豚鼠，体重320460g,34月龄，购H第三军医高校动物试验中心。激光共聚焦显微镜（1.eica公司），RM6240多通道生理检测仪（成都仪器厂.），微晶输液泵（3M公司），羊抗豚鼠Ckit多克隆抗体（SantaCrUZ公司），大鼠抗豚鼠平滑肌肌动蛋白（SMM）单克隆抗体（Sigma公司），驴抗羊AF488荧光二抗、驴抗大鼠F594荧光二抗（MOIeCUIarProbeS公司），DAPI细胞核染料（碧云天公司）。1.2试验方法1.2.1豚鼠膀胱流出道部分梗阻模型建立参照KUbota7等人的试验方法构建豚鼠Dl模型。简述如下：1与戊巴比妥钠(50m
10、gkg)腹腔注射麻醉，将直径为1mm的硬膜外导管经尿道外口插入膀胱，以此作为尿道支撑。取下腹部正中切口，长约1.52cm,切开皮肤及皮下组织,剪开腹直肌前鞘腱膜，分别腹宜肌，找到膀胱，细致游离膀胱-尿道交界处，近端尿道稍作分别，于此处穿过2-0丝线，结扎近端尿道，结扎丝线的松紧标准以牵拉探子时四周组织可随之移动，而探子乂可轻易拔除为度，然后拔除探子，逐层健合关闭切口。假手术组动物依据上述手术方法行开腹及近端尿道钝性分别，但不行结扎梗阻试验，作为比照。术后每只豚鼠单笼喂养，保持动物笼清洁干燥。全部试验动物术后适后运用抗生素：庆大霉素05mgkg,腹腔注射，1次d,共3d01.2.2 豚鼠膀胱尿动
11、力学检测PBOO手术4周后行尿动力学检测。25%乌拉坦溶液按1g/kg体重腹腔内注射麻醉。豚鼠取仰卧位，四肢固定，乙醇消毒尿道外口及会阴部，将外直径为1mm的硬膜外导管经尿道外口插入膀胱(见尿液流出)；若为PBOO后模型豚鼠，可打开腹腔解除梗阻后再行插入。轻压豚鼠腹部，排尽尿液，导管接5号针头，经三通管与尿动力检测仪及微址灌注泵相连。设置测压参数：压力模式，扫描速度10sdiv,灵敏度12.5cmH20,时间常数直流，采集频率400Hz,滤波频率30Hz：标定零点。用微M灌注泵以0.2rnl/min速率灌注，膀胱灌注液采纳生理盐水，同步记录随容积增加膀胱压力波形、膀胱容拈以及排尿间隔时间。1.
12、2.3 豚鼠膀胱组织铺片和冰冻切片免疫荧光染色在标本制作中运用组织冰冻切片和组织全层铺片两种方法，前者主要视察拈膜下ICC；而后者主要用于视察肌层的ICCo组织铺片的制作方法为：断颈处死动物，下腹部正中切口暴露膀胱，结扎双侧输尿管，将4%多聚甲醛臼尿道注入膀胱内，维持充盈状态并固定10min。将充盈的膀胱剪下置入4%多聚甲醛中接者固定68h后，沿腹侧面纵行剪开，在解剖显微镜下，当心剔除黏膜层。将肌层组织制成含12层肌细胞厚度约100-200m的组织铺片。冰冻切片的制作方法为：动物处死和标本采集同上，膀胱组织4%多聚甲醛固定68h,10f30%蔗糖溶液梯度脱水过夜，-20C下OCT冰冻包埋液包埋
13、组织，冰冻切片机沿垂宜于黏膜层方向行20m冰冻切片，贴于多聚赖氨酸处理防脱载玻片表面。切片和铺片标本的荧光染色方法相同，简述如下：1%BSA室温孵育1h后加入羊抗豚鼠Ckit(1:100)和大鼠抗豚鼠SMM(1:100)一抗4C孵育过夜，PBS漂洗3次，每次IOmin,加入驴抗羊AF488和驴抗大鼠AF594荧光二抗室温孵育lh,DAPI复染细胞核IOmin,PBS漂洗2次，每次IOmino激光共聚焦显微镜视察。1.2.4 统计学方法数据用XS表示，SPSSII.0软件进行t检验。2结果2.1PBOO模型制作和尿动力学检测PBOO模型组动物18只：比照组动物5只。模型组意外死亡4只，解除试验，
14、比照组动物全部存活。比照组膀胱充盈性测压曲线较平滑，排尿反射存在，充盈过程中可视察到少设臼发性收缩，幅度微小,如图IA所示。PBOO后9只豚鼠出现膈胱测压曲线不平滑，膝胱容制及压力增加，排尿反射频繁，充盈过程中Fl发性收缩波幅增大（P005）,定义为DO组（图1BO另5只豚鼠梗阻后压力稳定膀胱测压曲线较平滑，膀胱容置和排尿压力均显著大于正常比照组，膀胱充盈过程中未见（或罕见）自发性收缩波，定义为逼尿肌稳定（DetrUSorStable,DS）组（图100各组的尿动力学检测结果见表Io2.2膀胱组织免疫荧光染色组织铺片荧光染色可见豚鼠膀胱组织平滑肌束间和肌束内有形态典型的ckit阳性的I（X细胞
15、（封4图3A,箭头所示），大部分细胞呈纺锤形或长梭形有突起，散在分布于平滑肌肌束之间，少址存在于平滑肌肌束内，缺乏相互的连接。少比ckit阳性细胞为圆形或类圆形无突起和侧枝（封4图3A,星形所示），依据文献报道，该类细胞为肥大细胞。DS组豚鼠膀胱组织ckit染色阳性的ICC细胞分倘和形态与比照组类似（封4图3B）c而在DO组我们视察到ckit阳性的ICC的形态和组织结构发生了变更（封4图3C）,逼尿肌束之间的ICC排列较为紊乱，细胞突起数Q较比照组和DS组明显增多且相互视察到排尿连接呈网状，（封4图3中A为比照组、B为DS组、C为DO组,箭头示ICC星号示肥大细胞。比照组和DS组ICC分布相对
16、散在，相互之间缺乏联系，或联系较松散；而DO组膀胱逼尿肌束间可见ICC相互联系增加且相互联结呈网络状。绿色荧光标记ckit；红色荧光标记为SMM阳性的平滑肌细胞，蓝色荧光为DAPI标记的细胞核。以上三幅图片放大倍数相同，标尺长度为50m）o在切片标本中我们主要视察黏膜下层ICC,正常膝胱和DS膝胱中黏膜下ckit阳性的ICC紧贴黏膜层，相互之间首尾相接，呈12层排列（封4图4A,B）,而DO膀胱中黏膜下ICC层次明显增多，ICC排列较为紊乱（封4图40黏膜层由于上皮细胞对抗体的黏附作用，因此SMM和Ckit均为阳性，染色呈金黄色（封4图4中星号标记），（封4图4中，A：比照组：B：DS组：C：
17、DO组，箭头示ICC星号示膀胱黏膜，绿色荧光标记Ckit染色阳性的ICC,标记为绿色荧光；红色荧光标记为SMM阳性的平滑肌细胞，蓝色荧光为DAPI标记的细胞核，以上三幅图片放大倍数相同，标尺长度为50m）。图1各组膀胱充盈测压曲线（略）A、B、C分别为比照组、DS组和DO组，箭头示表1各组动物充盈性膀胱测压结果（略）与比照组比较，P0.05；与DS组比较,P0.053探讨DO是常见的膀胱功能障碍性疾病。以往基于神经限制理论，提出了很多DO发病机制的假说，如:神经超敏学说、受体分布失衡学说等等89但是临床上针对DO的治疗难以取得令人满足的疗效。很多学者都发觉r膀胱逼尿肌在去神经状态下可以出现自发
18、性的收缩，这种自发的逼尿肌活动在DO膈胱中具有高频率、低阈值的特点。因此，膀胱功能调控除r神经因素之外的膀胱源性局部因素受到了越来越多的关注。很多探讨都表明，膀胱平滑肌的兴奋调控可能与一种特别的间质细胞，ICC有关。膀胱中存在ICC最初是在2002年由英国学者McCloskey发觉10,在他的一系列探讨中探讨了膀胱ICC的分布、形态学特征及其与神经的相互关系，2007年的第五届国际Cajal间质细胞论坛建议将泌尿系这一类与胃肠道ICC有相像形态学特征的间质细胞命名为泌尿系ICC11,本文对于该类间质细胞的命名也借鉴上述标准。目前的探讨表明，膝胱ICC有与胃肠道ICC类似自发性兴奋的特点，乙酰胆
19、碱等神经递质可兴奋膀胱ICC12,但是关于膀胱TCC的功能学探讨目前尚不成熟。借鉴胃肠道ICC的分群方法，可将膀胱ICC依据其主要分布特征分为：膀胱黏膜下层ICCdCCSU)和膀胱肌束间ICC(ICCMY)以及肌束内ICC(ICCIM)1,13,为了能更好地视察各群ICC的分布，我们在试验中采纳冰冻切片和组织铺片的方法分别视察黏膜下和肌层的ICCo我们的探讨表明，ICC在DO膀胱中的形态和结构发生了一系列变更，主要表现在肌间层ICC相互连接增加和黏膜下层ICC分布的变更，由于膀胱ICC具有Fl发性兴奋性的特点，其相互联系的增加可能是整个唠胱兴奋性变更的结构基础。当然并非全部的动物在PBOO之后
20、都发生了ICC的变更，部分梗阻后逼尿肌稳定(DS组)的动物膝胱IeC与正常膀胱类似。我们推想这可能与动物对手术耐受的个体差异以及梗阻的时间等因素有关，但由于梗阻时间过长难以保证动物的存活率，因此我们将梗阻时间限制在4周以内。这也进一步证明ricc与do的发生存在密切的关系。到目前为止，膀胱IeC相关的探讨还很有限，但是越来越多的证据表明：ICC对于膀胱正常生理功能的维持有着重要的意义，是正常排尿生理和泌尿系统病理生理学探讨的新方向。同时，ICC在膀胱功能障碍中的作用也引起越来越多的关注。ICC结构和功能的异样可能是DO重要的发病机制之一。【参考文献】1DavidsonRA,McCloskeyK
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