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1、CharacterizationofPhomaadonidico1.acausingaspotb1.ightOnAdonispa1.aestina摘要Adonispa1.aestinaBOiSS.是产生红色虾青素的三大自然来源之一。虾青素是有价值的抗氧化功能食物，也是饲养酷鱼的食物添加剂.H2004年以来，一种枯萎病对其造成显著伤害，在中国内蒙占发生。病害在寄主植物的叶柄、茎部引起小褐色病斑，该病害最早在田间使植物下部产生褐色坏死，最终扩展至整个植株，使其叶片全部脱落。从病部分离所得真菌，按其形态特征鉴定为茎点霉属，根据1.SU(大亚基-28S),ITS(ITS1-5.8S-ITS21.),和
2、TUB(B微管蛋白)系统发育树分析，Radonidico1.a落于与Stagonosporopsisajacis密切相关的相同的良好支持分支。Padonidico1.a的所有菌株使接种后的植物出现典型的斑点并从有症状的组织成功地再次分离。A.Pa1.aeStina的疾病被提议称为斑枯病关键词：前言Adonispa1.aestinaBoiss.(RanuncuIaceae)是二倍体一年生草本植物,源于巴勒斯坦，以色列，黎巴嫩，约旦和叙利亚，含有丰富的虾青素，尤其是在鲜红色花瓣中。(WangI994;RaytOnetaI.2006).红色类胡萝卜素虾青素不仅是营养药物工业中强劲的抗氧化剂(FaSS
3、ettandCoombes2009;Higuera-Ciaparaeta1.2006;Pashkoweta1.2008),也是水产养殖业中的鱼食品添加剂，因为它赋予了养殖蜂鱼（例如鲜鱼，蹲鱼）和甲壳类动物（例如虾）令人满意的粉色。（Raytoneta1.2006;Seybo1.dandGoodwin1.959）o商业颜料主要通过化学方法合成，部分从某些天然来源部分提取的，如甲壳类动物，酵母Phaffiarhod。Zyma和绿藻Haematococcusp1.uvia1.is0从Apa1.aestina中提取虾青素经济实惠，既避免了化学污染又减少了与副产物的积累，这就此植物宝贵的自然资源。200
4、4年中国用进A.pa1.aestina在内蒙占地区大量繁殖来生产虾青素。2004年夏天在中国内蒙占内通辽地区进行植物病害田间调杏期间，发现使A.pa1.aestina的叶片、叶柄及茎部产生斑点的病害。这些斑点通常相互联合造成地上组织枯萎，被推测可能与真菌茎点霉属adonidico1.a相关。自发现以来,病害严重时可使A.pa1.aestina的产量造成高达60%的损失，直接威胁A.pa1.aestina的可持续生产。本文针对病原体的特性描述以及建立对疾病的科学防治基础。材料和方法病原的分离继在田间观察病情的发展，随机从中国内蒙占通辽市五大商业领域选择了五至七株病株。典型症状的茎，根和叶柄在1%
5、次氯酸钠溶液中浸泡5分钟，然后用无菌蒸储水漂洗三次进行表面消毒。在无菌条件下从病灶边缘切（约5X5考米）的小片组织并置于含有100UgmI-I硫酸链霉素的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA（200克土豆，20g的葡萄糖，20g的琼脂/1升蒸谭水）。将平板培养在黑暗中26-28C。3至5天后，将真菌菌落转移至新鲜的PDA板，并在26-28C培养。真菌分离物由单个泡子装置传代培养用于纯化，随后转移至PDA斜面在4C下存储。纯化的真菌菌落的菌丝体悬浮于15%甘油冷冻管，并在-80C长期储存。致病性检测22C暗培养7天后打取5mm直径菌块接种在燕麦培养基诱导其形成胞子，平板置于近紫外光，12小时光周期22C培养
6、8天。用5m1.无菌水冲洗平板制备的子悬浮液。泡子收集时用饱子悬浮液浇注无菌透镜擦拭纸，通过血球计数器统计抱子个数并以无菌水调节至5106个/m1.。将A.Pa1.aestina种子用1%次氯酸钠溶液消毒十分钟后接种到经170干热灭菌2h的土壤：泥炭：蛭石2:1:1混合物的花盆中，所得的嫩叶用来接种。致病性试验是在露室(2224C,70%RH)下进行。被选定为致病性测定的二十八个真菌菌株来自植物的多个部位(茎，叶柄和根;表1),地点和生长期。四个月大的植物用含有吐温20的抱子悬浮液(0.025%)均匀喷雾，直至径流。每个实验重任三次，每次10株植物，其中对照植物用无菌水喷雾。接种过的幼苗套聚乙
7、烯袋48h以保持潮湿条件，放于室内12h光周期培养。4-8天后计算病害严重程度计算。植株的病害严重程度以表面积的感染的百分比为基础。分为额定0至5个级别，其中0=没有症状，1=小于所莅盖的植物表面的10%,2=10-25%,3=2550%,4=50到75%,5=75100%导致植物死亡。病情指数按以下公式计算：DSI结果中的0为没有植物被感染和100为所有额定植物感病死亡。用SAS程序对DSI数据进行方差分析。从人工接种植物上分离的病原菌使植物表现该病的典型症状。病原菌鉴定茎点客属的菌株首先进行形态学鉴定,将菌株接种于燕麦培养基22C,近紫外光下12h光周期培养7天。在第7天跟第14天测定菌落
8、直径，色斑大小，分生抱子形态并在OA培养基边缘滴加NaOH观察颜色变化来测定扩散性抗生素代谢物E1.系统发育分析，12个茎点霉属真菌基因组DNA照FastDNAkit和FastPrepFP-24的说明书提取。对该DNA序列的三个区域进行分析：1.SU(1.argeSubunit-28S),ITS(ITS1-5.8S-ITS2范圜，a和TUB(%微管蛋白).1.SU区域同1.ROR和1.R7进行扩增,ITS区域用引物ITS1.和ITS4进行扩增。TUB区域用TB2Fd和TB4Rd进行扩增。PCR反应在MyCyC1.erN热循环仪中加入501总体积中进行，其组成为5的易Taq缓冲液，4I的dNTP
9、s(2.5亳摩尔)，每种引物1.(IOUM),HaysTaqDNA聚合酶0.5I(IUper50U1.),10到50纳克的DNA模板，高度纯化的无菌水的36.5U1.应用在所有的PCR设置中，包括不含DNA的阴性对照。所有三个区域循环参数为95C下5分钟，随后的在95C下30秒35个循环，退火(见下文)，在722分钟，随后在72C7分钟。退火工序分别为ISU45秒48C,ITS在48C50秒，TUB3O秒52C。PCR产物用1%（重量/体积）0.111gm1.的溟化乙锭在IXTAE缓冲液（0.4摩尔Tris,0.05M的醋酸钠,0.01MEDTA,PH值7.85）的琼脂糖凝胶中进行电泳分析,并
10、在紫外光下观察。IU2KP1.USI1.（TansGen生物技术，北京，中国）为标准尺寸。PCR产物的纯化和测序使用北京生物医学有限公司生产的相同的引物组合。序列的组装和编辑采用G叩4的STADEN包裹。两侧的模糊区域通过分析排除。序列查询提交国家生物技术信息中心b1.ast网络服务器。最大简约（MP）分析使用米加4.0软件个体的基因数据集，为首次执行。一旦拓扑一致性在三个数据集中建立，这三个数据集成为拥包含100o引导程序重复在内的关联支路支持的联合数据集。系统发育分析还包括从GenBank中获得的由Aveskamp和Vaghefi等所产生的数据集。壳二饱大麦var.hordei（CBS54
11、4.74）和茎点霉属雀稗（CBS560.81&CBS561.81）的序列被用于外群体。结果病症及菌株分离当日常温度达到20-25C,有降水发生时，本病最初在植物上发病为五月底或六月初。典型症状表现为植物茎基部和下部接近土壤的叶柄出现小的黄棕色的病变。（图Ia）随着时间的推移，病变逐渐增大，聚结，成为坏死和黑褐色，覆盖大部分的茎和叶柄（图1.b）o随着植物生长，病灶扩展到植物的上部（图1.c）0将病株根系纵向解剖，在中央维管组织中观察到深褐色的条纹（图Id）随着病情的发展，病株下部叶片逐渐变成深褐色，并在干旱条件下干燥破裂（图1.e）o在严重感染的叶片提前落叶，只留下茎杆（图比）。当病变组织置于
12、含有湿滤纸培养皿中培养，几天后可观察到茎点客属典型的分生抱子器。因此这种疾病被命名为斑枯病。Fig.1在M间AdOniSPaIaeStina的咬病的症状.a.地面以上的早期感染的叶柄;b病灶摄盅植物衣面的大部分;C,茎上分散的黄褐色病灶；d,在根的纵战面的中央城.管组织的限制标色条纹;e,田间抽点期症状;f,田间后期拄状从野外采集病变样品总共分离菌株226株。其中148株从病株的茎,叶柄和根中分离得到，显示茎点客属的典型形态。（图2）而且，Phomasp从茎和叶柄中的分离频率最高，其次是根。（图2）包括茎点霉属在内，包括28株镰刀菌，24株PIeCtoSPoriUm,24株链格胞以及炭疽2株从
13、患病组织中获得（图2被选定为致病性测定二十八株（15茎点霉属,2个镰刀菌属,5个P1.ectosporium和2个炭疽菌属:表1）来自不同部位（茎，叶柄或根），地点和生长期。Rg.2患病Adonispa1.aestina中分离各种真菌的频率茎点毒属（Pho）;P1.ectosporiumSP（P1.e）;交鞋抱属（A1.T）;糠刀苗属（FUS）;炭疽菌属（CO1.）OVa1.uesrepresentthemeansof35p1.ants致病性枪测(M。Uanba1.1.1.uq1.eos一在A.pa1.aestina植物上茎点霉属所有菌株接种后2-3天造成典型病灶（表1），且症状类似于那些在田
14、间观察到的（图3a）。茎接种后5-6天观察到分生抱子器（图3b）。一些接种的植物的根维管组织变成暗棕色。我们还注意到5株P1.ectosporiumsp引起茎和叶柄上褐色小病灶（图3c,表1）。然而，从接种的植物的这些病变中的分生抱子器与茎点霉屈菌株引发病灶的分生泡子器观察到的外观不同。镰刀菌属、链格抱属或炭疽菌属的菌株在接种后均不显症。（表1）,对照植物无病症（表1）。P.Adonidico1.a是从人工接种的植物的病组织重新分离。这些结果表明,茎点霉属是为A.pa1.aestina斑枯病的症状负责。Fig3接种茎点和M或PIeCtOSPOriUm后AdOniSPagestina植物的症状.
15、a.茎点的M引起症状;b茎点毒尿分生抱了器对植物接杷aPIeCtaSpOriUmSP引起症状病原菌的鉴定基于菌落的生长，色素形成以及分生泡子，分生抱子器和厚垣泡子的特点，所有从Apa1.aestina分离得到的茎点霉属菌株显示茎点霉属adonidico1.a的典型特征。P.adonidico1.a的形态学鉴定结果由多基因分析进一步证实。被检查株茎点霉属的1.SU(GenBank登记号JQ934854-JQ934865),11S(GenBank登记号JQ934830-JQ934841)或TUB(GenBank登记号JQ934842-JQ934853)序列与Stagonosporopsisajac
16、is的序列最为相似,(同义词P.ajacis)菌株CBS176.93和CBS177.93和S.va1.eriane1.1.ae(同义词P.Va1.eriane1.1.ae)菌株CBS273.92andCBS392.76从单个数据集所生成的系统发生树产生几乎相同的分枝拓扑，联合数据集由包括a1.ignmentgaps(1.SU:1327;ITS:495andTUB:341)在内的2163个字符组成。这些字符中有1884个(ISU:1260;ITS:403andTUB:221)是常量,而279个字符(1.SU:67;ITS:92andTUB:120)是简约信息.联合序列系统发育分析表明，所有从中国
17、APa1.aeStinain分离得到的P.Adonidico1.a独特的和广泛支持分支，与S.ajacis参考株分组(图4)。这些结果表明,从APa1.aeStina分离的P.adonidico1.a的菌株是同种的,但于Stagonosporopsis或茎点霉属的种不同。F.g.4Radon1.dico1.a和基1.SU,ITS和TUB的掂因组合序列数据的相关品种的邻居接合部树。各节点的百分数表示以100O重新来样数据集的邻接法分析为基础的引导程序支持的水平。比例尺表示得核讦酸位置用0.005替挨.树扎根于Ascochytahordeivar.hordei(CBSS44.74)和Phomapa
18、spa1.i(CBS561.81andS60.81)T：Ex-typestrain；B:ReferencestrainaccordingtoBoeremaeta1.(2004)讨论在这项研究中，我们已经证明，P.adonidico1.a是对受感染A.pa1.aestina植物中占主导地位的菌落，它们在人为条件下引起对接种的植物生长室内的典型的褐色病变。仅在一些但不是所有该区域的病株中，当根系纵向解剖，观察到与在人工接种植物中一致的粗褐色维管束。因此，这些研究结果表明，P.adonidico1.a是维管束组织的变色的致病因子。此外，在与坏死叶柄的黑褐色的维管束组织连接的茎的植物上，在其根上也观察
19、到黑褐色的维管束组织（图Id）。这些观察表明，在该区域的根维管组织的变色可能是由于茎的感染所引起。因此，我们的研究结果表明，于2004年内蒙古F1.其第一次出现使A.pa1.aestina花卉生产显著损失相关的茎枯病是由真菌P.adonidico1.a引起的决定性。以往的研究表明，由R甜菜夜蛾造成的斑枯与Radonidico1.a斑点是密切相关的，偶尔在葛苣叶中发生是因为接触或接近土壤。在我们的研究中,P.adonidico1.a引起A.pa1.aestina的斑枯病也在降雨或灌溉后首次植物接近地面部分观察到。这可能是由于土壤附近的高湖度这对病原体是有益的。与P.exigua,相同，长时间潮湿
20、条件可能为P.adonidico1.a在A.pa1.aestina上诱发疾病症状是必要的。这里，我们表明PIeCtOSPOriUmSP.还可以在APa1.aeStina引起斑点。然而，症状与来自那些由Padonidis后引起的明显不同（图3）。鉴于P1.ectosporium复苏的发病率较低。从Apa1.aestina（图2）,我们不认为P1.ectosporium是A.pa1.aestina斑枯病的主要病原体。在Apa1.aestinais不清楚茎点和P1.ectosporium之间的关系。进一步的研究应确定这些真菌是否存在协同作用造成更大的疾病严重程度。茎点客属的基因已被认为是一个共同的大
21、的真菌族群，并且它通常是难以确定的真菌物种的水平。目前广泛应用的识别系统分属分为九个部分，这是非常有帮助的形态学鉴定。然而，这一细分主要是基于儿个形态或已被证明或是不明确的生理特征。Aveskamp等(2010)结合其他相关属的形态学和分子研究重新评估茎点客属边界以及种和变种的重新分级，这被认为是更现实的和更可靠的。2006年AdonidiCOIa在形态学特征上进行鉴定，但没有通过分子生物学的研究证实。在本研究中，进行了系统发育分析探讨其分类地位。所WPadonidico1.a的分离株在系统发育检测接近Stagonosporopsis参考株，特别是S.ajacis,这表明Radonidico1.a和S.ajacis在亲缘关系上紧密。然而，从A.pa1.aestina上分离得到P.adonidico1.a的所有检查菌株形成了独特的和广泛支持分支(图4),P.adonidico1.a的形态与S.ajacis不同。前者只生产一种类型的分生的子，而后者通常产生两种类型的分生胞子。这些结果表明，它们是不同的物种，即使它们彼此系统发育接近。这项研究包括形态数据，多基因的序列分析，和致病性测试,以证明中国A.pa1.aestina的班枯病的主要病原是P.adonidico1.a,这些信息将有助于种植者成功地控制病情。需要进一步研究以获得潜在的控制措施和疾病的减少的信息。
