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1、INH基因调控番茄果实品质的功能鉴定一、项目提出的目的及意义；演着社会的快速发展和人民生活水平的不断提南，人们对蔬菜品质越来越关注。特别是在国际市场上，品质不佳已成为制约我国番茄打入国际市场的瓶颈。因北在现有高产量的基础上梃高我国番茄果实的品质水平巳成为今后番茄育种的研究重点.番茄果实可溶性固形物含量的高低时番茄果实的营养品原有着重要影响，而且对加工番茄来说，可溶性固形物每消加1%就相当于增加25%的总产量。同时还可大福度喊少加工费用。其次，蔗糖作为番茄重要品质指标之一，它的积累会大幅度梃高番茄的营养品商和风味品质，其中高糖番茄栽培巳成为许多发达国家的1.种现代栽培技术备受关注。所以在今后的苗
2、茹育种实践中要通过可溶性固形物含量提高番茄果实品质就必需通过提高番茄果实的蔗糖枳累量来实现。二、与项目相关的国内外发展概况及市场需求分析；目前已明确蔗糖代谢关键诲主要有三类，即转化带或称B-映喃果糖昔琦(AI)、蔗稻合成酹(SS)和蔗菇磷酸合成酶(SPS),其中转化用在番茄的生长和果实发育过程中发挥着重要作用，尤其是酸性转化酶作用最为明显。但直接在番茄中通过转化照基因的反义表达虽可明显提尚果实的可溶性固形物和蔗稔含量.但同时番茄果实的大小也明显受到抑制。而另一种方式就是通过在翻译后水平调控抑制子基因(IN1.I)的表达来进行，且目前抑制子研究已成为近年来的研究热点之一,备受人们的关注。有关该基
3、因的功能已了解到以下几个方面的作用：转化施抑制子可抑制糖用甜菜采后转化萌活性，从而增加采后蔗糖的稳定性；转化博抑制子可抑制马铃薯块茎抗“低温糖化”:转化薛抑制于可调控种子发育进程。有关番茹转化前种制子蛋白自1994年被PreSSey首先纯化以来，对其生化特性进行了系统分析和，这种KUnitZ-type的转化蒋抑制子可以抑制马铃薯(So/a/wmSZwOS/血块茎可溶性转化葡活性海划，并在拟南芥发育的花粉中大量表达卬。然而有关番茄中转化酶抑制子基因的克隆及在番茄果实蔗想代谢中的研究尚未见报道。本研究是在前人的研究及课邈组已有研究的基础上XG,即在课题组已弄清了番茄果实蔗糖代谢关钺营活性及其基因表
4、达特性，确定了转化瞥在番茄果实蔗糖代谢的重要作用；研变了不同环境条件下番茄果实蔗塘代谢的变化，证实番茄转化苗对非生物逆境基因表达的变化规律；确定了番茄果实不同部位转化前分离提取的稳定试验系统及活性测定方法等基础上设计的。本研究以看茹为我材，一方而克隆春茹转化抑制子基因(INH)全长及时空表达分析，进一步明确其在乔茹生长发育中的作用机理；另一方面进行转并因分析探讨转化抑制于在番茄果实成熟过程中藉代*中作用的分子机理以及还原糖积累与液泡转化活性的关系，为栽培春茹进行高糖生产黑供防黑路，也可为我国看茹品质W种提供新品系.三、主要攻关内容及技术路线(技术可行性分析)；3.1 研究内容：3.1.1 番茹
5、转化酶抑制子基因(NH)cDNA全长的分离与鉴定。AINH基因CDNA全长的克隆B序列测定与同源性分析3.1.2 不同发育时期不同器官组织/N基因的时空表达分析。ANorthern杂交分析不同菱檐代谢类型畲茄“源”叶与果实/N”的时空表达变化B定量RT-PCR方法分析不同蔗糖代谢类型番茄“源”叶与果实/N”的时空表达变化3.1.3 /N”转化番茄植株的功能鉴定。A/AT/转化番茄再生体系建立与转化研究B转化植株的分子鉴定C转化植株转化莺活性与可溶性糖含量分析技术路线本研究以番茄为试材，一方面克隆番茄INH基因全长并进行时空表达分析，探讨转化用抑制子与转化用活性关系,进一步明确两者的作用机理；另
6、一方面进行转基因分析探讨转化营抑制子在番茄果实成熟过程中蔗糖代谢中作用的分子机理以及还原糖积累与液泡转化落活性的关系，技术路线如下：四、现有工作基础和条件；立项依据有坚实的理论与实践基础“本研究是参阅大量文献并结合自身以往的植物蔗菇代谢研究基础，特别是结合近年辽宁省博士后基金资助研究成果，在番茄蔗糖代谢及相关睥活性关系分析、转化由时空表达特征化的前期工作基础上，提出的对番茄转化峙活性调控的新探索。本研究是申请者博士后斫究课题的深入，是孙威、李冬妮和杨芳税士学位论文的主要内容。本研究组掌握了国内外在植物蛋白抑制子在发有、环境及硬信号中的最新研究动态，与自身实践相结合，在理论上、实践上均有可靠基础
7、。相关实验技术成熟，实验结果可信.本研究使用的实监方法和分子生物学技术等多为国内外应用多年的经典方法，并有自身实践基础。本课题组由掌握以上技术的成员组成，相关技术已应用于科研工作。人员配备合理，具有扎实的相关工作基础和完善的实验设备及技术支持。申请人目前正从事番茹蔗糖代谢关键畴表达与活性研究，承担辽宁省教育厅年高等学校科学技术研究项目“盆脓迫时番茄蔗塘代谢关键而基因表达影响的研究”的研究工作，项目组主要成员参与并完成以上研究工作。实脸设计指导者.熟炼技术人员及辅助人员等各司其职，可保障研究有条不紊的进行.五、申请人基础条件（包括主要研究成果）；研究基础申请者1996年以来就从事植物代谢生理及分
8、子生物学方面的研究,至今已经发表相关论文10余篇，与本项目直接相关的文献综述及研究论文9篇，指导完成番茄蔗糖代谢调控的硕士论文1篇，正在指导与本项目直接相关的硕士论文3篇。从2003年开始研究番茄蔗菇代谢的调控问题,主要关注番茄果实蔗菇代谢关键照基因活性及其表达特性，克隆了番茄转化萌基因并确定了能化诲在番茄果实不同部位不同发育时期的表达变化；研究了不同环境条件下（盐分胁迫、尚温胁迫、水桶酸处理）番茄果实蔗糖代谢与相关酹活性的变化，证实番茄转化将对非生物逆境基因表达的变化规律；确定了番茄果实不同部位转化琦分离提取的稳定试殷系统及活性测定方法。这些研究结果时本项目研究奠定了坚实的基础。工作条件申请
9、者所在单位沈阳农业大学蔬菜学科为国家重点学科,拥有可种植实超材料的日光温室、道料大棚及各种设施I万余平方米，学科所属的植物生理生化实验室、殂培室及学科实骏室具有完成本项目的主要仪器（低温冰箱、低温超速高心机、PCR仪、高效液相色谱仪）和试腔条件，掌握了基因克隆技术以及常规的分子生物学技术。但是尚缺乏纯化用的部分层析柱，精帘PH计、涡旋器等需要更新。总体上本研究已经能够开展，预计可顺利完成各项任务指标.申请人债历姜晶，女，副教投，博士1992年9月-1996年7月沈阳既范学院生物系生物专业获理学学士学位1996年9月1999年7月沈阳农业大学植物生理专业获理学硕士学位1999年9月-2003年4
10、月中国农业大学植物生理专业获理学博士学位2003年9月2006年12月沈阳农业大学园艺学博士后2003年5月一至今沈阳农业大学团艺学院任教主要从事蔬菜育种与生物技术的研究和教学工作。在藐菜作物生理学和分子生物学等方面已积累了一定的研究基础，尤其在植物细胞信号转导与蔗糖代谢关键博基因的表达调控方面有较深入的研究。现主持辽宁省教育厅年高等学校科学技术研究项目“我胁迫对番茄蔗糖代谢关钝悔基因表达影响的研究”(2006.1-2007.12)和辽宁省博士后基金资助“糖代谢相关曙基因在番茄光合运转糖-蔗馥代谢中的活性及表达变化“(2003.1.0-2006.1.0),曾参加国家自然科学基因项目“番茄花柄脱
11、落相关畴-多聚半孔糖醛酸苗的性质及其基因表达的钙素调控”(2(X)5.1-2007.12),“利用蛋白质组技术快速分离与鉴定水稻於盐性相关蛋白质”(2003.1-2005.12)等项目研究。发表的与本研究有关的论文：英晶李伟李天来.番茄酸性转化照CDNA片段的克隆与表达分析.园艺学报.25.32(5):885-888类李天来.番茄点精代谢关键基因的分子生物学研究.生物技术,2(X)5,1:82-85李伟姜晶李天来.盐胁迫对苗期番茄蔗糖代谢的影响.中国农学通报，2005.12:184-186JiangJing.Fan1.in-wcn.WuWci-hua.EvidencesforInvo1.vem
12、entofEndogenouscAMPinDefenseResponsesofArahidopsistoVertici1.1.iuinToxin.Ce1.1.Research.2005,15(8):585-592姜晶李伟郭金妹.李天来.乙酰水杨酸对番茄果实内各部位糖分含量的影响.沈阳农业大学学报，2006,37(3):467-469姜品李伟郭金妹李天来.乙武水杨酸对番茄果实品质与产量的影响.北方圆艺,2006.(4)：14-15姜晶季天来郭金妹鲁少尉.乙酸水梅酸在番茄果实发育期间对芨稔代谢相关好活性的影响.植物生理学通讯.2007.43(4):649-652姜晶李伟李天来,乙酰水杨酸对盐胁迫下
13、番茄蔗糖代谢关键萌活性与基因表达的影响.沈阳农业大学学报.2007.38(I):30.M郭金妹李天来姜晶李媛赵宏志.昼间亚杰温对番茄叶片糖含量和蔗地代谢相关晦活性日变化的影响。植物生理学通讯，2007,43(2)：231-234JiangJing,1.iTai-1.ai.1.uShao-wei.Sucrosemetabo1.ismandfruitqua1.ityof1.ycopersiconunderJif1.eringsa1.inity.JU11SCi(SUbmitted)六、进度安排和实施方案；年度研究计划：2009012009I2完成转化诲抑制子基因CDNA全长克隆，及原核表达载体、薛写
14、双杂交战体及植物表达载体的构建：完成番茄再生体系赛立和相关参数的优化；2O1O.O12O1OI2完成转化酶和制子基因时空表达分析；体外纯化转化诙抑制子(原核表达系统).共孵育法检测箕对番茄不同转化的抑制作用；完成酵母双杂交的互作强弱分析；2011.01-2011.12获得番茄转化植株，进行分子鉴定；测定转基因植株的转化酶活性与可溶性糖含量。实施方案：第一部分INH基因全长CDNA的获得与鉴定以番茄叶片和果实为材料.采用TriZO1.试剂提取总RNA,采用RT-PCR及5-RACE方法，以锚定引物(AAGCTInC和AAGCT1.oG)和T7(TGGCTCACTATAGGG)为引物进行笫一僮CD
15、NA的合成；以笫一链反转录产物为模板，以T7和特异引物(根据数据库中已公布的番茄转化曲抑制子部分序列AJO1.o943和AW217953进行设计)，进行PCR扩增获得番茄转化着抑制子的全长CDNA序列。第二部分/N基因时空表达分析己需积累型番茄品种桃大郎C1.omotaro）与蔗糖积累型野生番茄（1.yctipersiconChmie1.eyvxki）分别在番茄花后每隔5天取样一次，直至果实完全成熟，将果实分为中果肉、心室隔壁与胶质胎座3个部位分别提取总RNA以转化薛抑制子的部分CDM序列为探针，进行WrtheE杂交分析或以番茄转化酶抑制子的部分d）N序列设计300500bp的引物序列,以番茄
16、组成性表达基因actin为内参对照进行RT-PCR的定量分析第三部分番茄INH基因对转化酶活性影响的分析原核表达我体的构建：将克隆的转化R5抑制子CDNA全长从测序载体中酶切后连接到表达我体PET-30a上，转化表达菌株B1.21中表达产物的纯化：含有转化诲抑制子的表达茴株在37（过夜培养后，转到含有Kan抗性的1.B培养基中培养一定时间，进行诱导表达，进行培养时间、pH.离子及温度等叁数的优化，确定诱导表达的最适参数番茄转化的纯化：分别以番茄叶片和成熟番茄果实为材料,参照Miron和SChaffer等（1991）方法纯化细胞壁结合型转化畴与可溶性转化陪原核表达产物对转化商活性的影响：通过体外
17、转化曲抑制子蛋白一转化商共聘育的方法,参考BraCho等（1990）方法测定剩余转化孱的活性。第四部分/N转化番茄的功能研究转化我体的构速：将克隆到的番茄/AH的CDNA全长从克窿我体上经适当薛场连入pBI121表达载体中.经酹访塞定正确后利用液氮冻散法导入根痛农杆菌1.BAM（M中，以农杆菌菌液为模板进行PCR饕定证明INH巳普入或杆菌中。番茄再生体系建立：采用本实舲室正在建立的番茄品种“桃尢郎”子叶再生体系，进行激亲组合徐逸和抗生素浓度试验，进行相关参数的优化。转化植株的获得：利用农杆翻1.BA4404介导，将番茄外植体与农杆菌共培养一段时间后，再进行筛选培养获得转化植株转化植株的分子鉴定
18、：采用PCR方法、Southern杂交和Northern杂交鉴定/N基因在转化植株中的存在与表达情况.转基因株系酸性转化禽活性测定与可溶性糖含量测定：取不同发育阶段的转基因番茄果实,酸性转化碑纯化测定采用Miron和SChHf1.er等(1991)方法，可溶性精(,蔗糖、果糖、葡萄糖)含量采用高效液相色谱/P1.C)进行分析。七、预期成果和考核目标；Ai期成果获得番茄/N基因的全长CDNA序列获得高效表达的转INH基因的番茄植株开发出拥有自主知识产权的转Ivi基因的番茄新品种在SQ源杂志上发表1篇论文，国内核心期刊发表3-4篇论文培养3-4名硕士生提供成果的方式： .提供转INH基因的番茄品系
19、1-2个。 .申请国家专利1项 .项目完成后，成果为国内领先，部分内容达到IS际先进水平.八、推广及应用前景：番茄果实可溶性固形物含量的高低对番茄果实的营养品质有着重要影响，而且对加工番茄来说，可溶性固形物每酒加1%就相当于增加25%的总产量。另据美国有关统计，番茄可溶性固形物每漕加1%,每年即可减少约7000万美元的加工费用。项目完成后，番茄可溶性固形物含量将较现有生产平均提高1%以上。本项目将为消费者提供高质量的蔬菜食品，提高人们的健康水平。因此也将具有很好的应用前景。十、申请单位主管部门意见。已按填报说明对申清人进行了资格审查，对申请书内容进行了审核，申报情况属实，同意申报并保证在项目获得资助后做到以卜.几点：(1)保证对研究计划实施所需的人力、物力和工作时间等条件给予支持：(2)严格遵守科技厅有关资助项目管理、财务等各项规定；(3)督促项目负贲人和本单位项目管理部门按科技厅的规定及时报送有关报表和材料。
