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1、支原体检测方法汇总一、培养法二、荧光指示细胞法三、PCR法四、扫描电子显微镜法目前实验室常用的支原体检测方法有培养法、荧光指示细胞法、PCR法、扫描电子显微镜法，这些方法各有优缺点。各实验室可根据具体情况，选择不同的方法，或几种方法联合使用。一、培养法培养法为最为经济可靠的方法，但其实验周期较长，所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。（一）材料与设备1 .精氨酸肉汤培养基按说明称量粉剂，蒸用水配制，高压除菌（力口20%胎牛血清）。2 .支原体琼脂培养基按说明称量粉剂，蒸锵水配制，高压除菌（力口20%胎牛血清）。3 .其他超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管
2、/皿、37t培养箱。（二）操作步骤L样品的储存。样品取材后，最好尽快进行检测。样品如在24h以内进行支原体检测，可储存在289；如果超过24h样品应放置于一2（C以下保存。-2（C保存的样品，进行检测时需重新加入到对照培养细胞中，培养72h后，取上清直接进行接种检测。2.准备精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基（半流体）。3,将样品分别接种到10ml精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中（已冷却至36）,每支培养基接种样品05L0mL每种样品接种6支精氨酸肉汤培养基，3支半流体培养基。4.接种6d后，取3支精氨酸肉汤培养基中样品0.51.0ml.复种于精氨酸肉汤培养基中。5.36培养295每隔3（1观
3、察一次。记录实验结果。（三）结果判断培养结束时，精氨酸肉汤培养基如有支原体生长，则液体颜色改变（粉色或黄色）。半流体培养基中如有支原体生长，则出现絮状沉淀二、荧光指示细胞法荧光指示细胞法较为快捷，方法简单，但其灵敏度有一定的欠缺，易造成漏检。常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞法。该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱，其激发波长为350nm（紫外激发），发射波长为420nm。该染料会结合到DNA中富含A-T的区域，由于支原体的DNA中A-T含量占多数（55%80%）,所以可被染色而检测到。支原体污染的细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体DN
4、A,证明该细胞有支原体污染。（一）材料与设备L荧光显微镜。2.CO2培养箱。3.无菌小爬片。4.无菌培养皿。5 .不含抗生素的完全培养液。6 .二苯甲酰胺荧光染料浓缩液（50gml）o称取5mg二苯甲酰胺荧光染料加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hanks平衡盐溶液中，在室温下用磁力搅拌3040min,使完全溶解，一2（C避光保存。7 .二苯甲酰胺荧光染料工作液（0.5gml）取1ml上述浓缩液，加至至0ml无酚红和碳酸氢钠的Hanks溶液中,终浓度为0.5gmlo8,固定液，即乙酸：甲醇（1:3）溶液为细胞固定液。9 .封片液。0.lmolL枸檬酸22.2ml,0.2molLNa2HP041
5、2H2027.8ml,丙三醇50.0ml,以上三者混匀，调pH至5.5。10 .不含酚红和碳酸氢钠的Hanks平衡盐溶液或PBSo经多种方法检测确定为支原体阴性的VERO细胞。（二）操作步骤1 .无菌收集待测细胞上清：悬浮细胞离心后取上清液。2 .VER0细胞爬片：将爬片无菌置于小培养皿内，滴加VERO细胞悬液（细胞浓度约3X104个ml）23ml,置于C02培养箱内培养24h使其贴壁。3 .制备标本。向6孔板内滴加待检细胞上清液约1ml,注意设立对照组（已证实的支原体阳性和阴性细胞上清液），培养48h后（VERO细胞汇合前）将细胞爬片从平皿中取出。4 .漂洗一将细胞爬片置于培养皿中，用不含酚
6、红、NaHC03的Hanks溶液（或PBS）漂洗3次。5 .固定一用乙酸：甲醇（1:3）固定液固定10min.6 ,漂洗一待固定液自然风干后用去离子水漂洗3次。7 .染色一置于Hoechst33258工作液(0.5gml)中染色10mio8,漂洗一去离子水中漂洗3次，每次l2min.9.封片，紫外激发，观察。（三）结果判断当阴性及阳性对照结果均成立时，结果有效。1 .阴性结果仅见待检细胞的细胞核呈现蓝色荧光。2 .阳性结果荧光显微镜下细胞周围或细胞膜表面可见大小不等、不规则的蓝色荧光小点和丝状点。（四）小结L严格配制工作液及封片液。3 .保证作为指示细胞的VERO细胞没有被支原体污染。4 .必
7、须同时设立阳性及阴性对照，注意重复，以排除假阳性和假阴性结果。4.应全面观察爬片，并注意可疑阳性的荧光点是凋亡小体还是支原体污染。5.可适当调整荧光染料的工作浓度和染色时间，避免出现非特异性染色，如胞浆着色。三、PCR法PCR法检测支原体的方法最为快速、灵敏、取样量少，既可做细胞本身，也可做细胞上清的检测，同时可以检测多种支原体的污染，是目前常用的检测手段。但其成本较高，条件要求严格，且有时易出现假阳性或假阴性。弥补的方法是对怀疑样品要经过3次PCR检测，或用培养法检测。PCR法是20世纪80年代中期建立起来的一种体外DNA扩增实验，其基本原理是酶促DNA合成反应，即在DNA模板、引物和脱氧核
8、糖核酸存在下，经DNA聚合酶的作用，使DNA链扩增延伸。该实验具有灵敏度高、特异性强、检测快速的特点，但其对实验环境要求严格，实验成本较高，有时还会出现假阳性的现象。（一）材料与设备支原体PCR检测试剂盒、dNTP、Taq-DNA聚合酶、缓冲溶液、琼脂糖、矿物油、超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混旋器等。（二）操作步骤1 .样品的收集。待测细胞用无双抗培养液培养7d,用无菌容器取上清液500ul,4cC保存待测。2 .模板的制作。在无菌的条件下，取细胞培养上清100ul于无菌的05d塑料离心管内，盖好盖子，95。（2水浴加热5min。3 .打开盖子,向管内加St
9、rataCleanResinlOul,盖好盖子，旋涡混悬器混合，离心510s,吸取上清至一新的塑料离心管中，模板制作完毕，4保存。4 .PCR反应。反应体系适合条件为lOmmol/LTris-HCI（pH8.38）,50mmolLKCI,l.52.5mmolLMgC12,200molLdNTP,2UTaqDNA聚合酶，总反应体系为50ul,反应用去离子水均需用紫外灯照射。（1）在0.5ml塑料离心管中加入35.2ul去离子水及5ull0xTaq反应缓冲溶液。(2)依次加入下列成分：0.4uldNTP(25mmolL).0.4ulTaq酶(5Uul)、2ul引物。(3)加2u(去离子水，总体积4
10、5ul0(4)加5ul已制成的模板到反应体系中。(5)阳性对照，内对照各5ul加入到各自的反应体系中。(6)取1支含有以上反应体系的离心管，加入5ul去离子水作为阴性对照管。(7)在反应体系中加入100ul矿物油。(8) PCR程序见下表。5琼脂糖凝胶电泳。PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为2%o电泳结束后，凝胶成像分析结果。6.结果分析。该方法为检测支原体的定性方法，在电泳泳道上，Marker、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带，当被检样品泳道出现明亮条带，且位置在阳性对照和内对照条带位置之间，即可认为该样品被支原体污染。有时还会发现一条泳道出现多条，可能是该样品感染
11、2种以上支原体所致。如果泳道内条带隐约出现，则可怀疑有支原体污染，重做该样品。(三)注意事项PCR反应的前期操作应在无菌环境中进行。注意假阳性、假阴性，有时需多次重复。四、扫描电子显微镜法扫描电子显微镜法：扫描电子显微镜法非常直观、准确，对使用环境要求高，操作复杂，实验周期较长，常作为样品的最后定性检测。(一)原理利用电子显微镜超级放大功能，直接观察培养细胞中支原体污染情况。（二）材料与设备待检测细胞,0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA25%的戊二酸、1%钺酸、0.lmolL磷酸缓冲溶液（pH7.4）,扫描电镜及相关设备。（三）操作步骤1 .将待检测细胞传代至贴有盖玻片的培养皿中。2.37oC,C02培养箱中培养24h,取出盖玻片。3 .以PBS洗涤3次。4 .以2.5%戊二醛85固定15min,PBS洗涤。5 .以1%钺酸固定30min,PBS洗涤。6 .乙酸异戊酯脱水。7 .C02冰点干燥。8 .喷金。9 .扫描电镜观察，照相。（四）结果分析支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎，因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。
