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1、2022卵巢储备功能下降小鼠模型研究进展(全文)摘要卵巢储备功能下降(decreasedovarianreserve,DOR)损害女性身心健康。因伦理原因，难以对人体卵巢组织进行研究，构建DOR动物模型是解决这一难题的办法。构造DOR动物模型有助于研究其病理生理及探索治疗措施。目前构建小鼠DOR模型的方法主要有：使用药物(化疗药物、干扰代谢类药物、免疫调节剂等I射线照射、基因工程、环境毒物损伤等，这些造模方法各具特点，其中注射化疗药物环磷酰胺是建立DOR小鼠模型的一种较好的方法，具有操作简单、经济、周期快、效果确切、易重复、卵巢损伤程度可控的优点。本文对DOR小鼠常用建模方法的原理及特点进行综
2、述。卵巢储备功能下降(decreasedovarianreserve,DOR)是指女性卵巢卵泡数量减少，或伴有质量下降，导致月经周期紊乱、经量减少、闭经、生育力下降甚至不孕等一系列临床表现的生殖系统病变。DOR诊断标准为卵泡刺激素(follicle-stimulatinghormone,FSH)10U/L或抗苗勒管激素(anti-Mullerianhormone,AMH)1.0gL10DOR在不孕症人群中发病率约为10%2z近年来有增高趋势。DOR病因尚未完全清楚，与年龄、放化疗、手术损伤、烟酒等不良嗜好以及遗传因素等有关，部分患者原因不明。目前DOR尚无有效的治疗方法，戒除烟酒嗜好、调整月经
3、周期、使用抗氧化剂，有生育需求者采用诱导排卵或辅助生殖技术，以期达到对症治疗。因此，探索DOR的病因、病理改变、发病机制、治疗措施有望对疾病的治疗取得突破性进展。但受伦理限制，难以用人的卵巢组织进行研究，DoR动物模型有助于解决这一难题。目前国内外文献报道了多种DOR动物模型造模方法，国内已有DOR动物模型相关综述3,但是动物种类未统一，具体造模方法的剂量、异同点比较、是否可逆等有待深入阐述。DOR造模最常用的动物是68周龄小鼠。Kalantaridou等41998年提出切除小鼠胸腺建立自身免疫型DOR小鼠模型，之后国内外陆续报道了多种建模方法。不论何种方法造模，DOR小鼠均出现以下特征性改变
4、：动情周期紊乱或消失，自然受孕率下降；卵巢萎缩、体积变小、重量减轻、苍白；显微镜下见卵巢组织卵泡减少、血管稀疏、间质增生，闭锁卵泡数目增加，卵母细胞内形成空泡；血液中雌二醇水平下降、FSH水平升高等5L以上病理改变作为DOR造模成功的检测标准。各种造模方法存在机制、用法、有效性、价格等差异，尚无统一的造模方法。以下分别对常用的几种非自然衰老DOR小鼠造模方法进行综述。一.肿瘤化疗药物建立DOR小鼠模型1.环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX):CTX是临床上常用的化疗药物，可以使细胞DNA断裂，抑制RNA转录和蛋白质合成，从而产生细胞毒性作用。CTX的生殖毒性主要针对卵巢组织，可
5、以导致卵巢组织发生DOR特征性改变，甚至发生永久性损伤6-8LCTX一般采用腹腔注射，常用剂量有以下几种：采用78周龄的雌性ICR小鼠,CTX每日120mg/kg,连续腹腔注射14d后，小鼠血浆雌二醇降低到47%,AMH降低至52%9o李彩霞等5报道给予56周龄的雌性昆明小鼠一次性腹腔注射CTX120mg/kg,同时皮内注射白消安(busulfan,BUS)12mg/kg一次。BUS是一种治疗慢性粒细胞白血病的药物，长期使用可导致性功能减退、月经不调等。注射后Id、5d、IOd的卵巢仍有各个发育阶段的卵泡存在，卵巢萎缩不明显。注射后30d、60d卵巢萎缩明显，出现DOR特征性改变，并出现卵巢皮
6、质增厚，间质纤维化、坏死，卵泡颗粒细胞层次减少、排列紊乱、细胞间隙增大。可见CTX与BUS联合造模，DOR病理改变随注射时间延长而加重，卵巢纤维化损害可能不可逆。Shen等10报道采用78周龄的雌性BALB/c小鼠,首剂腹腔注射CTX50mg/kg,然后连续14d每日注射8mg/kg,除了出现DoR特征性改变，还出现卵母细胞透明带异常，卵巢黄体数量明显减少、体积缩小、形状不规则。造模成功后再予人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUCMSCs)0.2mL(l106mL)进行尾静脉注射，每周1次，4周后DOR损伤出现可逆性改变：小鼠动
7、情周期恢复正常、卵巢体积增大、雌二醇水平升高、FSH水平降低等。上述几种剂量的CTX均成功造模，且卵巢损伤程度随着CTX剂量增加、作用时间延长而加重。通过调整CTX的剂量、作用时间，可以控制卵巢DOR损伤程度，以适用于不同的研究目的。总之，CTX具有经济、易于获取、用法简单、造模周期短、效果确切、可重复性好、靶点明确、DOR损伤程度可控、损伤可逆的优点，是最常用的造模药物，尤其适用于DOR治疗性研究。2.顺粕(cisplatin,CDDP):CDDP用于治疗鼻咽癌、卵巢癌、膀胱癌、睾丸癌、淋巴癌等恶性肿瘤。CDDP的细胞毒性对生殖系统可造成损伤111WU等12报道对6周龄雌性C57BL/6J小
8、鼠连续7d腹腔注射CDDP每日2.5mg/kg,以生理盐水腹腔注射作为对照组。注射CDDP第3日小鼠发育卵泡明显少于对照组，闭锁卵泡明显增多。连续注射7d后，卵泡损害加重，闭锁卵泡更多，血浆雌二醇浓度明显降低，FSH水平升高。林妍等13报道松果菊苗(echinacoside,ECH)能保护小鼠卵巢组织免受CDDP的损伤：ECH降低顺粕诱导的FSH水平升高，升高小鼠卵巢细胞线粒体酶活性。CDDP价格高、不易获取，采用CDDP构建小鼠DOR模型的报道较少，需要进一步研究其适合剂量、造模效果、DOR损害是否可逆等。二.干预代谢类药物建立小鼠DOR模型细胞内半乳糖可被醛糖还原酶催化为半乳糖醇，细胞无法
9、进一步代谢半乳糖醇，造成半乳糖醇细胞内积聚，破坏细胞正常渗透压，导致细胞功能障碍。注射D-半乳糖会使小鼠卵巢细胞内半乳糖醇浓度增加，直接损害卵母细胞、颗粒细胞及卵泡膜细胞140D-半乳糖导致细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,RoS晚期糖基化终产物积累进而导致DOR15-16Jo何连利14报道对68周龄雌性小鼠每日皮下注射D-半乳糖200mg/kg,6周后小鼠出现消瘦、活动减少、精神萎靡、体毛晦暗无光泽、进食及大小便减少，卵巢出现DOR特征性改变。周越等17报道D-半乳糖可以建立小鼠多囊卵巢综合征(polycysticovariansyndrome,PCOS)模型：采用2
10、0周龄ICR雌性小鼠每日腹腔注射D-半乳糖200mg/kg,8周后小鼠动情周期紊乱、卵巢重量增加、单侧或双侧卵巢多囊性改变，血清睾酮、空腹血糖、空腹胰岛素明显升高。D-半乳糖构建小鼠PCOS模型的机制尚不明确。因D-半学廉建模效果文献报道存在矛盾性，造模效果可重复性差，其是否适用于建立DoR模型有待进一步研究。三.借助免疫损伤建立DOR模型1.雷公藤多昔片(tripterygiumglycoside,TG):是主要用于治疗自身免疫性疾病和风湿性关节炎的中成药，主要通过影响卵泡发育、抑制卵巢功能导致性腺毒性180长期使用TG可引起月经不调、闭经，甚至卵巢早衰190一项meta分析显示雷公藤具有明
11、显的生殖毒性，且月经紊乱发生风险随着用药时间延长而升高20o磷脂酰三磷酸肌醇/丝苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol3-kinase/proteinserinethreoninekinase,PI3KAKT)信号通路在卵泡发育中发挥重要作用，TG可能通过影响PI3K/AKT信号通路导致卵泡发育障碍210Yuan等22采用8周龄雌性Blab/c小鼠每日进行40mg/kgTG混悬液灌胃，14d后小鼠表现出活跃度降低、体毛松散晦暗无光泽、卵巢DOR特征性改变，子宫指数子宫指数=子宫湿重(mg)/处死前小鼠体质量(g)也降低。采用TG进行DOR小鼠造模的文献报道较少，造模有效性、可
12、重复性有待进一步研究。2.透明带糖蛋白3肽(peptideofzonapellucida3,pZP3):pZP3可诱导小鼠产生抗pZP3抗体(antibodytopeptideofzonapellucida3,AZP3Ab),与卵母细胞pZP3结合引起卵巢局部免疫紊乱，干扰卵母细胞与颗粒细胞之间的信息交换，引起卵巢萎缩、卵泡闭锁、卵母细胞损害和耗竭等DOR病理改变23-24o田海清等24对68周龄雌性BALB/c小鼠皮下注射pZP375gz2周注射1次。注射2周后血清雌二醇和FSH水平无明显变化；4周后血清雌二醇水平明显下降；6周后血清FSH水平明显升高，双侧卵巢出现DOR特征性改变，各级生长
13、卵泡明显减少，闭锁卵泡增加，间质严重纤维化。杨珍等25对pZP3造模成功的小鼠进行中药麟珠通煎煮液灌胃，6周后逆转卵巢DOR病理改变：血清FSH和LH水平降低、AMH水平升高、卵泡数增加等。因此推测免疫制剂造成的小鼠DOR改变是可逆的适用于DOR治疗性研究。但pZP3造模疗程长、价格贵、不易获取，限制了其应用。四.电离辐射方法建立DOR小鼠模型放射线可以损害细胞核，导致DNA复制障碍；激活p53途径，促进细胞凋亡，导致卵泡闭锁，影响受照射器官的结构和功能26-28o有丝分裂期的细胞比DNA合成期的细胞对射线敏感性更高，卵母细胞大部分时间处于有丝分裂期，因此易受射线损伤。卵巢颗粒细胞为卵母细胞发
14、育提供营养、生长因子等，放射线还可通过损害颗粒细胞，导致卵细胞营养供应障碍，从而间接损害卵母细胞5o李彩霞等5报道，对56周龄的雌性昆明小鼠进行0.5Gy60co-射线照射,照射率60cGy/min,照射野20CmX20Cm,距离80Cm,小鼠均出现精神萎靡、活动减少、脱毛、体质量下降。照射后第30日出现DOR特征性改变，且卵巢间质严重纤维化,皮质中仅存极少量卵泡，基质细胞大量丢失。60co-射线造模效果确切，但卵巢破坏严重，推测损害不可逆，不适用于DOR治疗性研究。小鼠受到电离辐射损伤，出现应激反应，卵巢外其他组织器官亦出现不同程度的损坏29,且该方法对研究者存在射线损伤的风险，不适合推广使
15、用。五.基因工程模型文献报道敲除小鼠的WdrLRPS26、HFMl基因可以构建DOR模型30-32,石志云等30报道敲除小鼠生殖细胞Wdrl基因出现卵巢体积缩小、卵泡数量减少。LiU等31报道敲除小鼠卵母细胞RPS26基因会导致卵泡停滞于窦前卵泡阶段，不能发育至窦卵泡，Wang等32报道敲除小鼠卵母细胞HFMl基因可导致小鼠卵泡储备减少及生育能力下降。基因敲除技术建模适用于研究与特定基因突变相关的DoR,以及基因突变导致DOR的分子机制，如干扰激素分泌、改变基因碱基序列从而改变编码的氨基酸、影响染色体重组等330再进一步针对导致DOR的分子机制，采用相应的药物治疗，但目前尚未见基因工程建模后，
16、再采用药物治疗DOR的相关报道，因此该建模方法在DOR治疗性研究中的作用有待探索。基因敲除技术难度高、价格昂贵、普及性差、小鼠饲养繁育要求高限制了其应用范围34;且基因突变在DOR发病中的确切机制不明确，某些DOR表型并未发现基因突变，因此其建模有效性有待进一步研究。六.环境毒物损伤模型近年来DOR发病率呈上升趋势，可能与环境污染加剧有关35J,多环芳羟(polycyclicaromatichydrocarbons,PAHs)是在环境中持续存在的一种有机污染物，主要来源于火山喷发、造纸漂白程序、燃料不完全燃烧时产生的烟气、有机氯制造等,广泛存在于水、空气或土壤中36o盛菲等36报道将育龄期小鼠
17、卵巢置于PAHs培养液中，可导致卵泡数量减少、颗粒细胞凋亡。与DOR相关的环境毒物成分复杂，建模不可控因素较多，且DOR程度不易控制。另外，大多数环境毒物除了可以导致DOR,还会影响全身其他器官、系统，缺乏靶向性，因此，较少采用这种方法建模。七总结综上所述，目前尚无统一的DOR小鼠造模方法，不同方法存在各自的特点。各种造模方法的有效性、适合剂量、适合周期、适用研究范围尚未完全明确，缺乏国内外指南及共识，需要加强基础研究。对于DOR治疗性研究，需要选择可逆性DOR损伤的造模方法。CTX应用较广泛、易操作、可重复性好,且DOR损伤可逆，细化研究CTX的剂量及周期有助于精确掌握造模程度，进而促进DOR的治疗性研究。
