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1、,双水相萃取技术,及其在生物医药上的应用,双水相萃取技术,双水相体系的概念与形成双水相萃取原理双水相萃取的技术特征双水相萃取的工艺流程,双水相体系的概念与形成,传统的双水相体系是指双高聚物双水相体系，其成相机理是由于高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就越大。,双水相萃取原理,双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水
2、键、氢键和离子键等) 的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示：K= C上/ C下InK = InKm+InKe+In Kh+InKb+InKs+InKc式中，Ke-静电作用对溶质分配系数的贡献； Kh- 疏水作用对溶质分配系数的贡献； Kb-生物亲和作用对溶质分配系数的贡献； Ks- 分子大小对溶质分配系数的贡献； Kc- 分子构型影响对溶质分配系数的贡献； Km -除上述因素外的其它因素影响对溶质分配系数的贡献。,双水相体系相图,双水相萃取的技术特征,含水量高(70-90)，在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；
3、可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质（或者酶），还能不经过破碎直接提取细胞内酶，省略了破碎或过滤等步骤；分相时间短，自然分相时间一般为5min15 min；界面张力小(10-7 10-4mNm)，有助于两相之间的质量传递，界面与试管壁形成的接触角几乎是直角；不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发物质，对人体无害；大量杂质可与固体物质一同除去；易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理；操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行；亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。有生物适应性，组成双水相的高聚物及某些无机盐对生物活性物质无伤害，不会引
4、起生物物质失活或变性,双水相萃取流程,目的产物的萃取PEG的循环无机盐的循环,（1）目的产物的萃取：第一步细胞悬浮液经助磨剂破碎后，与PEG和无机盐或葡聚糖在萃取器中混合，然后进入离心机分相。第二步萃取是将目标蛋白质转入富盐相 ,方法是在上相中加入盐 ,形成新的双水相体系 ,从而将蛋白质与 PEG分离 ,以利于使用超滤或透析将 PEG的回收利用和目标产物的进一步加工处理。若第一步萃取选择性不高 ,即上相中还含有较多杂蛋白及一些核酸、 糖和色素等 ,可通过加入适量的盐 ,再次形成 PEG/ 无机盐体系进行纯化。目标蛋白质仍留在 PEG相中。(2) PEG的循环 ：在大规模双水相萃取过程中 ,成相
5、材料的回收和循环使用 ,不仅可以减少废水处理的费用 ,还可以节约化学试剂 ,降低成本。PEG的回收有两种方法 ：一种是加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收,另一种是将 PEG相通过离子交换树脂 ,用洗脱剂先洗去 PEG,再洗出蛋白质。常用的方法是将第一步萃取的 PEG相或除去部分蛋白质的 PEG相循环利用(3)无机盐的循环 ：将含磷酸钠的盐相冷却 ,结晶 ,然后用离心机分离收集其它方法有电渗析法、膜分离法回收盐类或除去 PEG相的盐,双水相萃取原则流程,连续双水相萃取,双水相萃取技术在生物医药上的应用,1.基因工程药物的分离与提取,2.酶工程药物的分离与提取,3.抗生素的分离与提取,4.天然植物
6、药用有效成分的分离与提取,基因工程药物的分离与提取,目的的产物在转化液中的浓度很低 ,且对温度、酸、碱和有机溶剂较敏感 ,容易失活和变性 ,若以常规分离手段处理 ,产品的收率较低且纯度不高 ,而双水相萃取技术可以保证产物在温和的条件下得以分离和纯化。其中有代表性的工作是用 PEG4000/ 磷酸盐从重组大肠杆菌(E. Coli) 碎片中提取人生长激素(hGH) ,采用三级错流连续萃取 ,处理是为 15L/ h ,收率达 80 %。同样 ,用 PEG8000/ Na2SO4双水相系统从重组大肠杆菌中分离 IGF - I,收率 90 %。, 1 - 干扰素和- 干扰素的提取则是双水相亲和萃取技术的
7、应用。提取 1 - 干扰素是采用 PEG-磷酸酯/ 磷酸盐双水相系统 ,经两次萃取从重组大肠杆菌匀浆液中提取 ,分配系数达 155。较好的反萃取条件为 PEG- 磷酸酯、 酸盐 pH6. 0 ,其技术优点是省去高速离心去除细胞碎片的步骤 ,能耗较低 ,收率、 度均较高 ,最后 - 干扰素存在于磷酸盐相 ,其中 PEG含量仅为 0. 5 %左右 ,这对进一步纯化很有利。而采用 PEG- 磷酸酯/ 磷酸盐双水相可使-干扰素完全分配在上相 ,杂蛋白几乎全在下相 ,且干扰素浓度越高 ,分配系数越大 ,纯化因子高达350 ,收率 97 % ,用这一技术与层析技术相结合组成了一套新的分离流程 ,已成功地用
8、于工业生产。,酶工程药物的分离与提取,酶在医药方面的应用一是作为药用酶 ,二是用作化学合成药物中的酶催化剂。迄今 ,双水相萃取技术已广泛应用于生物大分子、细胞、细胞器、蛋白质、核酸、病毒、细菌、蓝藻、叶绿素、线粒体、 菌体等的分离与提取 ,几乎所有的酶均可用此技术仅通过调节 pH、合物和盐的种类或浓度 ,选择合适的分离条件就可进行理想的分离纯化。目前双水相萃取技术已成功应用于已较大规模提取纯化的酶有几十种 。其中成功地实现从微生物细胞碎片中提取纯化甲酸脱氢酶 ,其分离经 4 次连续萃取 ,已达处理 50kg 湿细胞规模 ,处理的酶蛋白含量已高达 150g ,收率为 90 %100 % ,由于工
9、艺简单 ,原材料成本较低 ,产品的价格也有大幅度降低。,工业上直接从发酵液中分离提取蛋白质和酶 ,绝大多数是用 PEG作上相成相聚合物 ,葡聚糖、盐溶液和羟甲基淀粉的其中一种作下相成相物质。从动物组织中提取酶制剂的最新研究是采用双水相亲和萃取技术从兔肌中提取乳酸脱氢酶 (LDH) ,选用进口染料 Cibaron Blue F3GA、 Procion Red HE2B 以及国产13 种活性染料作为亲和配基 ,改变了把亲和基配结合到成相组分上的传统做法。采用 PEG/ 无机盐、PEG/ 羟丙基淀粉系统和游离染料对 LDH亲和分配 ,设计二次萃取工艺流程 ,纯化因子达 7 ,收率达 80 %以上 ,
10、萃取过程稳定可靠 ,并且聚合物和染料得以充分循环使用。LDH 还可从猪肉中利用染料配基的PEG/葡聚糖双水相系统提取。除此之外 , 采用PEG1550/ 磷酸盐从牛肝和猪肾中提取和回收超氧化物歧化酶(SOD) ,过氧化氢酶和 D - 氨基酸氧化酶(DAO)进行研究和工业化开发也是很有意义的工作。,抗生素的分离与提取,数抗生素都存在于发酵液中 ,提取工艺路线复杂 ,能耗高 ,提取过程易变性失活。而双水相萃取在抗生素中具有较大的应用价值 ,萃取提取涉及到各类抗生素。- 内酰胺类抗生素是抗生素家族中应用最多的一类 ,主要由青霉素类和头孢菌素类构成。对青霉素进行工业化意义的双水相萃取是结合传统工艺溶媒
11、萃取法进行的。先以 PEG2000/ (NH4) 2SO4系统将青霉素从发酵液中提取到 PEG相 ,后用醋酸丁酯(BA)进行反萃 ,再结晶 ,处理 1000ml 青霉素发酵液 ,得青霉素晶体 7. 228g ,纯度 84. 15 % ,三步操作总收率 76. 56 %。,与传统工艺相比 ,它可直接处理发酵液 ,免去了发酵液过滤和预处理 ,减轻了劳动强度 ,将三次调节 pH值改为只调一次 ,减少了青霉素的失活。将三次萃取改为一次萃取 ,大大减少了溶媒用量 ,缩短了工艺流程 ,显示了双水相萃取技术在抗生素提取中潜在的应用价值。相当长的时间内 ,人们都认为双水相萃取技术只能用于大分子的分离 ,最近发
12、现用双水相萃取技术处理小分子抗生素取得了比较理想的效果 ,开辟了双水相萃取技术应用的新领域。,天然植物药用有效成分的分离与提取,中草药是我国医药宝库中的瑰宝 ,已有数千年的历史 ,但由于天然植物中所含的化合物众多 ,特别是中草药有效成分的确定和提取技术发展缓慢 ,使我国传统中药难以进军国际市场。因此 ,采用具有较高选择性和专一性的双水相萃取技术对中草药有效成分的提取是一项很有意义的工作。利用双水相萃取中草药有效成分具有代表性的工作是对黄岑甙和黄岑素的分离。,黄岑甙是中草药中具有代表性的一类药物 ,它是黄岑中具有药用价值的主要有效成份 ,有抗血小板凝集、抗肿瘤、降血脂、 压利尿和清除自由基等作用
13、。由于黄岑甙和黄岑素都有一定的增水性 ,在 PEG6000/ K 2HPO4系统中主要分配在富含 PEG的上相 ,且两种物质分配系数为 30 和 35。同时 ,分配系数随温度升高而降低 ,且黄岑甙的降幅比黄岑素大 ,通过一定手段去掉溶液中的 PEG,浓缩结晶可得到黄岑甙和黄岑素产品。,双水相萃取与原分离提取技术的对比,双水相萃取,作用条件温和 产品活性损失小 无有机溶剂残留 处理量大 分离步骤少 设备投资小 操作简单 ,可连续操作 ,易于放大,传统分离技术,处理量小 流程长 ,易失活 收率低成本高 不能与医药工业后处理工程要求相适应,双水相萃取技术目前的局限性,虽然双水相萃取技术在应用方面取得
14、了很大进展,但目前这些工作几乎都只是建立在实验数据的基础上,至今还没有一套比较完善的理论来解释生物大分子在体系中的分配机理。考虑到生物物质在双水相系统中分配时是一个由聚合物、聚合物(或无机盐) 、生物分子和水等构成的四元系统,系统中的组分性质千差万别,从晶体到无定形聚合物、从非极性到极性、从电解质到非电解质、从无机小分子到有机高分子甚至生物大分子,这些都不可避免地造成理论计算的复杂性。,易乳化、相分离时间长，成相聚合物的成本较高，水溶性高聚物大多数粘度较大，不易定量控制；水溶性的高聚物难以挥发，使反萃必不可少，高聚物回收困难等等而且，目前对于双水相体系的双水相动力学研究、双水相萃取设备流程研究、成相聚合物的重复使用以及普通有机物 - 无机盐双水相体系等方面相关文献报道比较少，有待于进一步研究和开发,双水相萃取技术的发展未来,建立溶质在双水相系统中分配的机理模型一直是双水相系统相关研究的重点和难点。随着对双水相体系研究的不断深入,性能优良的新型成相物质不断发现以及相关技术的不断发展,这些方面的问题将会逐步获得解决。随着双水相萃取技术的不断完善,双水相萃取技术将成为一种生物活性物质分离提纯的重要技术方法。,各种类型的双水相体系,典型的双水相提取酶蛋白的例子,谢谢观看,钟国柱,
