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1、第十一章 固相膜免疫分析技术（solid phase membrane-based immunoassy）,第十一章 固相膜免疫分析技术,定义：以微孔滤膜为固相载体微孔膜具有多孔性，像滤纸可被液体穿过（穿流）；也可向毛细管作用在膜上泳动(侧向横流)标记物：酶或各种有色离子（彩色乳胶、胶体金或胶体硒）标记抗体或抗原被检物：通过抗原抗体反应检测抗原或抗体结果: 可见的显色结果,固相膜免疫分析技术,定义：固相膜免疫分析技术,固相膜免疫测定的特点,固相膜免疫测定的特点优点不足之处简便，快速（1015min,斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA
2、)斑点金免疫层析试验（dot immunogold chromatography assay, DICA),临床上常用的固相膜免疫技术：,斑点酶免疫吸附试验(dot enzyme linked immunospot assay ,Dot-ELISA) 免疫印迹法(immunoblotting test, IBT),胶体金免疫技术,斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtr,第一节 胶体金免疫技术,colloidal gold immunoassay,1.原理： 以硝酸纤维素膜为载体，以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。2.常用胶体金免疫诊
3、断方法 斑点免疫金渗滤试验和斑点金免疫层析试验,第一节 胶体金免疫技术colloidal gold immu,一、胶体金和免疫金的制备(p46),定义：金盐被还原为金原子后形成的金颗粒悬液结构： 基础金核（原子Au）和双离子层内层：负离子层AuCl2-外层：正离子层的H+金颗粒间因静电作用互相排斥，成稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液。,（一）胶体金（colloidal gold）,一、胶体金和免疫金的制备(p46)定义：金盐被还原为金原子后,胶体金特性 胶体特性呈色性和光吸收性稳定性聚沉现象,胶体金特性,胶体特性 1100 nm，微小颗粒稳定、均匀、呈单一分散状态，成胶体金溶液。对电解质
4、敏感：可破坏胶体金的外周水化层胶体金凝聚成大颗粒沉淀某些蛋白质分子可稳定胶体金,胶体特性,呈色性和光吸收性 随颗粒大小改变。,颗粒大小不同，呈色不同：（小）25 nm 橙黄色；（中）1020 nm 酒红色；（较大）3080 nm紫红色。光吸收性也不同：随着直径增大，可见光区最大吸收峰波长增长，A680/A519比值增大。肉眼观察胶体金颜色或测定其吸收峰波长的变化粗略预估胶体金直径大小,呈色性和光吸收性 随颗粒大小改变。颗粒大小不同，呈色不同：,不同直径金颗粒的呈色性和光吸收性,胶体金颗粒（nm）胶体金特性16酒红色51824.5橙红色5,3. 稳定性 溶胶又是不稳定的体系，其溶剂化作用很弱，碰
5、撞时有合并为较大、较重颗粒的倾向。影响因素：胶粒间的相互吸引力： 距离近，引力大导致胶体颗粒合并变大胶粒与溶剂化层带电情况：各金胶带相同的电荷，同性电荷相斥，双电层越厚，胶粒带电量愈大，排斥力越大，越稳定。溶剂膜斥力：金颗粒间有一层厚的溶剂化膜，反抗金颗粒接近。膜斥力越大，越稳定。,3. 稳定性,4. 聚沉现象电解质：中和胶体金颗粒的电荷量，使溶剂层变薄，胶粒间排斥力减少，合并趋势增强。温度：越高，吸附能力减弱，溶剂化程度降低，不稳定性增加浓度：越高，粒子间距减少，引力增加,4. 聚沉现象,（二）胶体金的制备,制备原理（化学合成法） 氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的
6、疏水胶溶液。常用还原剂：柠檬酸三钠、鞣酸、维生素C、白磷、硼氢化钠等，根据还原剂的强弱可制备直径为0.8150 nm不等的胶体金。,（二）胶体金的制备制备原理（化学合成法）,配制0.01 HAuC14溶液，100mL 搅拌，煮沸 快速加入1柠檬酸三钠，2mL 煮沸15min，移除热源，继续搅拌至室温 恢复至原体积。d=16 nm,1 min内溶液由淡黄色转为灰色黑色酒红色,2. 常用制备方法,1 min内溶液由淡黄色转为灰色黑色酒红色2. 常用制备方法,胶体金粒径与柠檬酸三钠加入量的关系,加入不同量的柠檬酸三钠即可得不同粒径的胶体金,降低,增大,*100mL，0.01%氯金酸中加入的柠檬酸三钠
7、,胶体金颗粒（nm）1%柠檬酸三钠(mL)*162.0024.,3. 鉴定和保存（1）鉴定：粒径大小、粒径均一性，有无凝集颗粒肉眼观察：日光下观察颜色和浊度，若清亮透明即良好胶体金，若浑浊或液体表面有漂浮物提示有凝集颗粒。分光光度计：获得最大吸收波长（见图）透射电镜：精确测量胶体金平均粒径。测量100个以上，计算平均直径和标准差，平均直径（颗粒大小），标准差（均一性）,粗略估计,金纳米微粒体系的吸收光谱1. 12 nm; 2.19nm; 3. 24nm; 4. 33nm; 5. 41nm,金纳米微粒体系的吸收光谱,金纳米球电镜照片图 A：20nm；C金纳米棒： 5121nm,50 nm,100
8、 nm,王康林.纳米金共振散射相关光谱及其应用,2008,金纳米球电镜照片图50 nm100 nm王康林.纳米金共振散,胶 体 金（Colloidal Gold）1560 nm,优 质,劣 质,胶 体 金（Colloidal Gold）1560 nm,（2）保存：洁净的玻璃容器；室温避光无灰尘环境中保存3个月，4保存半年避免冻存：导致胶体金聚集。20天内标记：胶体金的不稳定性,（2）保存：,（三）免疫金的制备(P53),1.制备原理：原理：胶体金与抗原或抗体等大分子的结合。实质：抗原或抗体吸附在胶体金表面。吸附机制：不明确，可能是静电吸附作用。胶体金表面带负电荷蛋白质含正电荷的基团静电吸附作用
9、牢固结合。优点：物理吸附，不影响蛋白质的性质。,（三）免疫金的制备(P53)1.制备原理：,胶体金结合物（Conjugate）,胶体金结合物（Conjugate）,2. 技术要点：（1）胶体金溶液pH的调整（吸附作用取决于pH）接近蛋白质等电点或偏碱：低于等电点胶体金聚集失去结合能力。用0.1 mol/L K2CO3和0.1 mol/L HCl维持pH标记IgG（9.0）标记McAb（8.2）亲和层析抗体（7.6）SPA（5.96.2）ConA（8.0）亲和素（910）,2. 技术要点：,（2）蛋白质的最适标记量：方法：标记蛋白系列稀释各取一定量加入定量的胶体金试管中加入NaCl，混匀后静置数
10、小时设置对照管：不加蛋白或加入蛋白量不够。结果：从对照管开始溶液由蓝色逐变为红色。选维持红色管的最低蛋白含量作为稳定胶体金所必须的最适标计量,（2）蛋白质的最适标记量：,蛋白质的最适标计量,倍比稀释蛋白质,混匀，静置数小时,NaClAuNPs蛋白质的最适标计量对照倍比稀释,临床免疫学检验-课件-第11章-固相膜免疫分析技术1,原则：稳定胶体金所必须的最适标计量在最适标记量基础上增加蛋白含量10%20%即为标记全部胶体金溶液所需的蛋白总量,原则：,（3）标记过程： 在确定胶体金与蛋白的最适用比例后磁力搅拌下，将蛋白溶液逐渐加入胶体金溶液中数分钟后加入稳定剂（5%BSA或1%PEG20 000）（
11、4）金标记的纯化目的：除去未标记的蛋白、未充分标记的胶体金以及标记过程中形成的聚合物。方法：超速离心，凝胶过滤法,（3）标记过程：,3. 注意事项：（1）pH调节：注意胶体金可阻塞pH计的电极，不可直接插入胶体金中先用终浓度为0.1%PEG20 000稳定胶体金（2）蛋白质含盐量较高或形成聚合物影响标记过程。标记前用低浓度盐水透析数小时并高速离心除去聚合物。,3. 注意事项：,4. 免疫金保存 用含稳定剂的缓冲液稀释成工作液保存。缓冲液：中性PBS或Tris缓冲液稳定剂：蛋白质、葡萄糖（最常用）、PEG20 000、明胶 在免疫金中加50%甘油：-18可保存一年以上,4. 免疫金保存,二、胶体
12、金免疫技术的方法学种类与原理（p125-p127）,二、胶体金免疫技术的方法学,（一）斑点金免疫层析法（dot imumunogold chromatographic assay, DICA）,原理 胶体金标记技术与蛋白质层析技术相结合的以硝酸纤维素膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。样品借助毛细作用在层析条上泳动与固相的抗原或抗体结合形成复合物被富集或截留目测显色情况，判断结果,（一）斑点金免疫层析法原理,胶体金标记物,胶体金标记物,2. 方法类型（1）双抗体夹心法-检测大分子抗原,阳性：T和C处都变红色；阴性：只有C处变红色,G-金标特异性抗体（兔型）,A-标本,T-特异性抗体（兔型）,C
13、-二抗（羊抗兔免疫球蛋白抗体）,过量,2. 方法类型阳性：T和C处都变红色；阴性：只有C处变红色G,结果观察,阳性,阴性,无效,T,C,结果观察 阳性阴性无效TC,临床免疫学检验-课件-第11章-固相膜免疫分析技术1,（2）竞争法-检测小分子抗原,免疫层析竞争法原理示意图A-标本;G-金标抗体;T-标准抗原C-二抗（羊抗兔免疫球蛋白抗体）,阴性,阳性,T带不变色C带都变红色,T和C带变红色,少量,（2）竞争法-检测小分子抗原免疫层析竞争法原理示意图阴性阳性,3. 技术要点（1）试剂盒的组成主要成分胶体金层析条所用试剂全部为干试剂（2）操作要点：加样将试剂条标记线一端侵入待测标本中25 s或在标
14、本加样处加一定量待检标本，平放520 min内观察结果结果判断：因方法而异。注意无棕红色线质控带出现则试剂无效。,3. 技术要点,（二）斑点金免疫渗滤试验（dot imumunogold filtration assay, DIGFA）,原理 硝酸纤维素膜包被抗原或抗体,洗涤液,阳性：膜上呈红色斑点,是床旁实验（point of care test, POCT）主要方法之一，整个检测5min,（二）斑点金免疫渗滤试验原理洗涤液阳性：膜上呈红色斑点是床旁,盖,微孔膜,吸水垫料,底板,斑点免疫金渗滤装置,塑料小盒吸水垫固相抗体或抗原的硝酸纤维素膜,盖微孔膜吸水垫料底板斑点免疫金渗滤装置塑料小盒,2
15、. 方法类型（1）双抗体夹心法：,加入标本（抗原）与膜上的抗体快速结合，浓缩,胶体金标记抗体，免疫反应，浓缩,洗涤液洗去未结合的免疫金,阳性：膜上呈红色，胶体金聚集,硝酸纤维素膜上包被抗体,2. 方法类型加入标本（抗原）与膜上的抗体快速结合，浓缩胶体,固相Ab（NC膜）-待测Ag-Ab-胶体金,红色,洗涤液,洗涤液,AB固相Ab（NC膜）-待测Ag-Ab-胶体金红色洗涤液洗涤,（2）间接法：,加入标本（抗体）与膜上的抗原结合，浓缩,胶体金标记羊抗人IgG抗体，免疫反应,洗涤液,阳性：膜上呈红色（胶体金聚集）,硝酸纤维素膜上包被抗原,洗涤液,易产生假阳性，少用。人血清标本中含有非目的IgG的干扰
16、,（2）间接法：加入标本（抗体）与膜上的抗原结合，浓缩胶体金标,DIGFA结果判断,设质控质控点大小或性状不同于检测点,DIGFA结果判断设质控,DIGFA与DICA的比较,DIGFA与DICA的比较DIGFADICA试剂形式渗滤装置,（三）临床应用及评价,金免疫测定技术特点 操作简便、快捷、操作人员不需技术培训无需仪器设备，试剂稳定、便于保存适于“床旁检验”灵敏度问题不及酶标法和酶发光免疫测定法临床应用：定性或半定量试验主要用于正常体液中不存在的物质正常含量极低特殊情况下异常升高的物质（人HCG）,（三）临床应用及评价金免疫测定技术特点,第二节 其他膜载体免疫分析技术,以酶作为标记物的固相膜
17、免疫分析技术斑点酶免疫吸附试验免疫印迹试验,第二节 其他膜载体免疫分析技术以酶作为标记物的固相膜免疫分析,一、斑点酶吸附试验（dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA）,（一）原理原理同常规的ELISA不同之处：载体为硝酸纤维素膜（NC）吸附蛋白能力强，取代聚苯乙烯,一、斑点酶吸附试验（一）原理,阳性：有色沉淀物,斑点酶吸附试验原理示意图,洗涤,洗涤,包被抗原,阳性：有色沉淀物斑点酶吸附试验原理示意图洗涤洗涤包被抗原,抗原包被膜 12 L抗原于膜上包被后进行封闭2. 抗原抗体反应滴加样品血清，待检抗体与膜上抗原反应洗涤后加酶标记二抗。3.
18、 确定酶结合物最佳稀释度 阴性样品不显色，阳性样品显色最强的酶结合物稀释度4. 显色 加底物（HRP：盐酸联苯胺）形成不溶有色物 阳性：肉眼可见的染色斑点,（二）技术要点,抗原包被膜（二）技术要点,优点灵敏度高：NC吸附能力强，微量抗原吸附完全，故灵敏度比普通ELISA高68倍试剂用量少：比ELISA节约10倍实验及结果判断简单：不需仪器试剂稳定：吸附抗原（抗体）或已有结果的膜可长期保存可同时检测多种抗体,（三）方法学评价,优点（三）方法学评价,二、免疫印迹试验（ immunoblot test，IBT）,（一）原理凝胶电泳+免疫化学分析技术又称Western blot技术 检测蛋白质特性、表
19、达与分布的最常用方法,二、免疫印迹试验（ immunoblot test，IBT）,按分子大小分离,按分子大小分离,SDS-PAG：分离待检抗原 电转移条带至NC:100 v，12 A，通电45 min 酶免疫定位:+特异性抗体；+二抗: HRP标记 ；显色：二氨基联苯胺（棕色）或4-氯-1-萘酚（蓝紫色）根据SDS-PAGE时加入分子量标准确定各组分的分子量,SDS-PAG：分离待检抗原,引自王少辉博士论文,引自王少辉博士论文,（二）分类蛋白免疫印迹试验重组免疫印迹试验,（二）分类,1.蛋白免疫印迹试验,混合抗原样品单向或双向电泳分离转印到固相载体上（NC膜，尼龙膜等），保持生物学活性不变作
20、为抗原检测相应抗体（如酶、发光剂）与标记的而抗体反应（显色、发光检测）实现对特异性抗体进行检测如HIV抗体确认试验,1.蛋白免疫印迹试验混合抗原样品单向或双向电泳分离,2. 重组免疫印迹试验（RIBA）,利用基因重组的方法，将各种抗原表达、纯化后，包被在NC膜上，直接作为检测试剂条；或者直接合成抗原多肽用于病原体确认试验、复杂抗原成分的病原体分析、自身抗体的检测等特异性较ELISA高，灵敏度稍差,2. 重组免疫印迹试验（RIBA）利用基因重组的方法，将各种,HIV确证试验仪器和试剂,HIV确证试验仪器和试剂,1.抗体的性质：多选多克隆（识别耐变性表位），单克隆不能与变性抗原反应2.灵敏度提高方法:浓度低先浓缩或使用化学发光试剂、荧光试剂3.应用局限性：易出现假阳性或误差；一般不识别对构象依赖的表位的抗体，造成漏检。,（三）方法学评价,1.抗体的性质：多选多克隆（识别耐变性表位），单克隆不能与变,1.特异性强：可定性或定量检测第含量的抗原2.吸附蛋白能力强: NC膜吸附能力强，保存时间长3.操作简单，适合基层单位使用4. 膜条可重复检测应用,（三）方法学评价,1.特异性强：可定性或定量检测第含量的抗原（三）方法学评价,谢 谢,谢 谢,
