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1、一代测序,一代测序一般指Sanger测序，是上世纪70年代由sanger和Coulson开创的DNA双脱氧链终止法测序，当初几十个国家花了几十亿刀完成的人类基因组计划就是使用的改良版sanger测序。,Sanger测序一次可以读取600-1000bp的碱基，准确性十分之高，至今仍是正确性的金标准。该技术在当下依然被广泛应用，比如构建载体做克隆，基因敲除等实验都可以用到。但其通量实在太低，导致在很多情况下成本太高，难以广泛应用。一代、二代、三代测序都是利用DNA聚合酶原理，DNA聚合酶催化下一个脱氧核糖核苷酸5的磷酸和上一个脱氧核糖核苷酸3羟基形成磷酸二酯键，如果某个脱氧核糖核苷酸3羟基被脱氧或
2、者被叠氮钠修饰，则终止反应。,缺少3位的羟基的ddNTP结合到DNA链上，会使得后面的单脱氧核苷酸（dNTP）无法再聚合上来，致使聚合反应终止。,二代测序技术，又称为Next Generation Sequencing（NGS）技术，高通量测序技术，是为了改进一代测序通量过低的问题而出现的。刚面世时主要包括Roche公司的454技术、ABI公司的Solid技术和Illumina公司的Solexa技术。这三种技术都极大的提高了测序的通量，大大降低了测序成本和周期。其中Illumina公司凭借超低的测序成本和可以接受的读长，成为了目前最主流的二代测序公司，其测序成本近五年来从几千元1G（1G即10
3、亿碱基）降到了到今天的40多块钱。,化学试剂三羧基乙基膦（TCEP）淬灭荧光信号；有时荧光基团切割不完全给簇形成荧光背景，导致测序够长。叠氮保护基团遇到巯基试剂(如二巯基丙醇)会发生断裂，并在原来的位置形成羟基，供下一个碱基合上。,二代测序,文库的构建,a类微生物等的基因组DNA：采用酶或者超声波将基因组打断，然后用DNA聚合酶补平，并在3加一个A碱基；b类人等超大片段基因组：采用转座酶，Tn5本身是一个DNA转座子的转座酶，它可以带着自己的DNA在基因组上到处插入，研究人员就借用了Tn5的这个特点将其用于文库构建。,2.RT-PCR,c类基因组RNA：采用酶或者超声波将基因组打断，然后随机引
4、物进行反转录pcr，然后DNA聚合酶在cDNA的3加一个A碱基,二代测序,文库的构建,Rd1 SP： 第一条链测序引物；I7： 第一条测序完，用I7引物测序第一条链上的index 1序列；P5： 再用P5为引物测序第一条链上的index 2；Rd1 SP：第二条链测序引物；,因不同的样品可以同时在一个流动槽里进行测序反应，index 1和index 2 序列可以通过加或者不加来区分不同的样本来源；二代测序和一代测序最大的不同点在于其边合成边测序技术。,二代测序,二代测序,测序流动槽(flowcell)： 每个槽都有共价交联的两种oligo（P5和P7），分别与文库两端的接头互补。,DNA聚合酶
5、,NaOH解开双链后模板链被洗掉,桥式PCR合成另一条链,NaOH解开双链,P7,P5,二代测序,二代测序,化学方法切断,P5与流动槽共价连接的单链被切断后洗掉,流动槽加入引物Rd1 SP、DNA聚合酶、荧光标记的dNTP，对第一条链测序,一轮反应只能加上一个碱基，一个簇只能测150-300个反应。,洗掉杂质后加入引物I7，DNA聚合酶，荧光标记的dNTP，对index 1进行测序,洗掉杂质后，DNA聚合酶，荧光标记的dNTP，对index 2进行测序，并合成另一条链,P7与流动槽共价连接的单链被切断后洗掉,流动槽加入引物Rd2 SP、DNA聚合酶、荧光标记的dNTP，对第二条链测序。,合成一
6、个碱基就用激光扫描一次，每一个簇上都形成相应的信号，然后再合成一个碱基再扫描。二代测序技术虽然通量很高，成本低廉，但是读长实在太短，主流的Illumina测序仪，常规模式一个簇的一个反应只能测150-300bp的长度，如果测双链则是300-600bp，靠着软件算法上的进步才得以可用。测得长才是王道啊！由此三代测序走上了历史舞台。,二代测序,三代测序主要有两种技术：PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序技术，这两种技术的测序读长都可以达到几十kb的级别，远远高于二代测序技术。,SMRT Sequencing Technology,单
7、分子实时测序技术 （Single Molecular，Real Time）原理：边合成边测序的原则，一个纳米孔的底部共价结合一个生物素分子，通过链霉亲和素，将偶联生物素的DNA聚合酶锚定到纳米孔的底部，4种荧光标记的dNTP在碱基配对阶段发出不同光，根据光波长和峰值可判断进入碱基的类型，磷酸二酯键形成过程荧光基团被切掉。读长跟DNA聚合酶活性保持有关，长时间激光照射下可能蛋白变性。,三代测序,三代测序,SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有1050 nm的孔，当激光打在Z
8、MW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅地降低了背景荧光干扰。,三代测序,1GB=10亿pb,三代测序,三代测序,二代测序dNTP荧光标记在碱基上,三代测序dNTP荧光标记在5磷酸基团上,三代测序,四色荧光基团标记的dNTP加入ZMW孔中；与模板序列对应的dNTP进行配对，进入ZMW孔底物检测区域，激发光照射下发射对应的荧光，经过光学系统转化为对应的碱基识别信号；磷酸二酯键合成后，磷酸基团脱落，荧光基团随着脱落；重复-注：经过改良的DNA聚合酶每秒合成3个碱基，确保光学系统能够捕捉到相应碱性释放的荧光信号。而正
9、常的DNA聚合酶在天然状态下每秒合成100多个碱基，有的甚至达到1000多碱基。,三代测序,三代测序,SMRT 测序优势,优势1 ：超长读长,优势2 ：无GC偏好性,二代测序读长短，靠发软件算法才能拼接，如果遇到大基因组测序，有时无法在合理时间内完成拼接。,三代测序读长长，遇到大基因组测序，在极短时间内完可成拼接。,有报道称山羊全基因组测序三代测序比二代速度快了5倍。,测序不受GC含量的影响，因为构建文库过程无需PCR反应，PCR反应GC含量高的片段比GC含量低的片段扩增慢，所以二代测序GC含量高的片段出现概率要低。,三代测序,SMRT 测序优势,优势3 ：高准确率,单碱基的错误是由实时激光扫描的识别能力造成的。碱基合成速度太快会导致测序结果有缺少突变，碱基合成速度太慢会导致插入突变；但是多次翻滚重复测序会纠正错误率。,三代测序,SMRT 测序优势,优势3 ：高准确率,三代测序,SMRT 测序优势,优势4 ：实时检测碱基修饰信息,三代测序,三代测序,三代测序,SMRT 测序建库,三代测序,Thank you for time,
