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1、第19章：分子生物学常用技术4学时分子杂交、PCR、基因测序蛋白质研究技术(双向电泳，酵母双杂交)基因转移与基因剔除(含RNA干扰)第20章：基因工程4学时第21章：基因诊断与基因治疗4学时,第四篇：分子生物学技术与应用,第十九章,分子生物学常用技术,分子生物学技术能帮助我们干什么？,揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白质)的结构与功能DNA 水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位RNA 水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接分析蛋白质水平：蛋白质定量、定位、功能细胞与整体水平：基因在活体中的功能目的：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段,我们需要了解和掌握哪些基本技术？,基本技术：核酸：测
2、序、印迹、杂交、体外扩增技术蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用综合技术：基因工程技术转基因生物与基因敲除技术应用技术：基因诊断基因治疗,Molecular hybridization:利用已知核酸序列(探针/probe)检测与其互补的未知核酸序列用途：确认核酸序列间同源性对特定核酸序列进行定量自核酸混合体中辨认特定核酸序列,第一节：核酸分子杂交,一、基本原理,变性(denature)复性(renature)杂交(hybiridization),核酸变性,在特定变性因素作用下，DNA双螺旋解离的过程破坏氢键与疏水作用可导致变性热变性：高温可使核酸变性，温度高于 90时任何核酸双链都将变性酸碱
3、变性：pH11 时核酸将变性，DNA 使用碱变性，RNA 则不可化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如尿素或甲酰胺可使核酸变性,变性温度,Tm：melting temperature，解链温度或变性温度影响变性温度的因素：溶液的离子强度变性温度与离子强度 正相关，低盐利于变性DNA分子的 GC 含量GC(Tm69.3)2.24,核酸复性,变性的 DNA 单链相互识别并结合，恢复其天然双螺旋结构的过程复性类似与化学反应，需要一定反应时间,影响 DNA 复性速度的因素,DNA 分子的浓度：浓度高，复性快DNA 分子的长度：长片段复性速度慢DNA 分子的复杂性：重复序列复性速度快不同物种C0t曲线比
4、较 人类基因组C0t曲线,二、核酸探针,Probe：用于测定未知核酸片段的已知序列探针为 DNA 或 RNA，可以为单链或双链探针必需经过标记：放射性标记或非放射性标记,1.探针有哪些种类？,DNA 探针：常规探针 利用基因组 DNA 序列或 cDNA 序列合成的探针，一般为双链，也可制备成单链RNA 探针：高灵敏度探针 一般是通过体外转录而来，均为单链寡核苷酸探针(oligo-nucleotide)：用于点突变检测人工合成的短序列(20nt)，可自由选择序列,2.标记物有哪些？,标记物的要求：高度的灵敏性：足以检测到极微量的核酸序列高度的特异性：足以在大量非特异性序列中检测到特异的靶序列标记
5、物的种类：放射性同位素(radio isotope)非放射性标记物(non-radioactive label),放射性同位素,特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克级微量的核酸序列 gmggngpgfg常用的放射性同位素,放射性标记的核苷酸单体,dNTP or NTP5 or 3 P32 labelling,非放射性标记物,特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及放射性同位素地高辛：通过地高辛抗体结合并检测生物素：结合亲和素/链亲和素(avidin/streptavidin)化学发光物质：通过紫外激发或化学反应而发光电子密度标记物：金等重金属,3.如何检测杂交信号？,同位素标记物：盖革
6、计数器、液体闪烁计数器放射自显影(autoradiography),如何检测杂交信号？,非放射性标记物：酶联免疫技术(enzyme linked immuno-assay)化学发光(chemiluminescence),三、如何对核酸探针进行标记？,1.缺口平移,nick translation:适用于标记双链DNA控制 DNase I 的用量，可以控制探针的长度,2.非放探针的酶促标记,生物素或地高辛标记的核苷酸单体通过酶促反应可以参入探针,3.非放探针的化学标记,利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合,四、如何进行杂交？,样品(DNA or RNA)吸附于支持物尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等
7、与标记的探针杂交封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行缓冲液清洗控制温度与变性剂浓度显色放射自显影/酶联显色,五、杂交有哪些不同的方式？,斑点杂交：dot hybridizationSouthern 印迹杂交：Southern blotNorthern 印迹杂交：Northern blotWestern blotting：不是杂交原位杂交：in situ hybridization反 Northern 印迹杂交：reverse Northern blot基因芯片/DNA微阵列：Genechip/DNA microarray,dot hybridization,将核酸样品直接点在杂交膜上与探针进行杂交特
8、点：简便但特异性不高可探测核酸含量，但无法得知分子大小,Southern blot,Edwin Southern 创立的方法电泳技术与杂交结合，可显示靶 DNA 序列的长度可进行毛吸管转移、真空转移与电转移,电泳,转膜,杂交,Northern blot,类似于 Southern 印迹杂交的方法，用于 RNA 检测,in situ hybridization,原位杂交：特定 mRNA 的组织细胞分布,FISH,Fluorescence in situ hybridization(FISH)：特定基因的染色体定位,反 Northern 杂交与 DNA 芯片,反 Northern 杂交：将探针 DN
9、A 片段固定在杂交膜上，利用标记物标记的 RNA 进行杂交,第二节：聚合酶链式反应,PCR，polymerase chain reaction在体外选择性扩增特定 DNA 片段的高效手段70 年代有人提出 PCR 的设想，因缺乏寡核苷酸的合成手段和适合的酶而无法进行1984 年 Kary Mullis 发明 PCR，并因此获得 1993 年的诺贝尔化学奖全自动的热循环仪和多种 PCR 衍生技术使其成为重要的科学研究手段,一、PCR 的基本原理,在体外，以特定引物引导，通过 DNA 聚合酶选择性扩增特定区域变性(denature)退火(anneal)延伸(extension),DNA的体内复制,
10、引物酶,引物酶,DNA的体内复制,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA的体内复制,DNA加热解链,模板DNA,引物1,引物2,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,第1轮结束,第2轮开始,72,Taq,Taq,Taq,Taq,55,第2轮结束,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,重复1-3步25-30轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,新链延伸,DNA的体外扩增,热循环,DNA解链,PCR反应体系4种dNTP混合物
11、各200 mol/L引物 各0.1-0.5 mol/L模板DNA 0.12 gTaq DNA聚合酶 2.5 UMg2+1.5mmol/L,DNA的体外扩增,PCR 技术的特点,高度的灵敏性：理论上经 20 循环可将目的基因片段扩增 2201000000 倍高度的特异性：利用引物与模板的特异性配对，可保证扩增的特异性一对 20 碱基长引物的多样性为4401024应用的广泛性：目前已经成为分子生物学研究必不可少的手段操作的简便性：不需要复杂的设备和繁琐的流程,二、做 PCR 要有什么条件？,酶：Taq DNA 聚合酶模板 DNA：可以为基因组 DNA 或 cDNA引物：人工合成的寡核苷酸片段dNT
12、P：聚合反应的核苷酸单体缓冲液：包含特定的 pH、离子强度和 Mg2+反应程序：变性、退火、延伸组成的循环仪器：DNA 热循环仪，或称 PCR 仪,DNA聚合酶催化的聚合反应,dNTP,1.什么是耐热 DNA 聚合酶,早期 PCR 曾使用 DNA 聚合酶 I在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶延伸反应温度为 37，非特异性太多目前常用 Taq DNA 聚合酶纯化自嗜热水生菌(Thermus aquaticus)可耐受 95 高温，最适反应温度为 72 左右,Taq DNA polymerase,在 7075 范围活性最佳，每秒可延伸 150nt95 时的半衰期为 40 min按变性时间
13、1 min 计，能满足 30 循环的反应Taq 酶具有 5 3 聚合活性和 5 3外切活性不具备校读活性，错误率为 2104 左右错误合成的 DNA片段可以作为模板，循环数越多，最终扩增产物错误率越高只能用于检测，不适合基因克隆,有保真性的耐热 DNA 聚合酶吗？,Pfu DNA polymerase：常用的高保真耐热 DNA聚合酶有5 3 外切活性错误率约 1106适应于基因克隆,2.如何设计寡聚核苷酸引物？,引物(primer)是 PCR 反应必备的前提，对 PCR 产物类型、长度和反应的特异性具有决定作用PCR 需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段长度,引物设计原则,引物长度一般为
14、1530 核苷酸引物太短影响杂交体的稳定和特异性引物太长随机匹配序列增多，特异性反而下降GC 含量一般为 40 60应充分考虑退火温度(annealing temperature)GC 含量低，退火温度低，易出现非特异GC 含量高，非特异性结合也会增加引物解链温度粗略计算公式：引物的解链温度Tm4(GC)2(AT),引物设计原则,引物自身不应该存在链内互补序列，以防止出现发卡结构,两条引物间、同一引物的分子间不应存在互补序列出现互补易导致引物二聚体的出现，影响扩增效率,引物设计原则,避免引物与非特异序列间的同源性引物的 3，末端必须与模板完全互补，5，末端允许添加非配对序列5，末端允许添加非匹
15、配序列，如：酶切位点,5,3,3.如何选择 dNTP 和缓冲液?,dNTP 是聚合反应的底物常规使用浓度：0.2 mM each探针标记时，可使用同位素或非放标记的 dNTP缓冲液：特定的 pH 和离子强度Mg2浓度一般为 1.5 mMPCR mix：预制的便捷反应体系,4.用什么做模板 DNA？,PCR 的模板(template)可以是基因组 DNA 或 cDNA逆转录-PCR(reverse transcription PCR)：RT-PCR在利用 DNA 为模板进行扩增时纯化比较简单血液、病原体、体外培养细胞、甚至病理标本经简单处理后均可直接进行 PCR 扩增RNA 样品一般要经过严格纯
16、化，并逆转录未经纯化的 RNA 不稳定，无法进行逆转录反应体系中如存在 DNA，将对 RNA 扩增产生干扰,6.如何设计反应程序？,PCR 的循环数：理论上 20 25 即可满足扩增需要，但实际循环数一般为 25 35过多循环后到达平台期，继续延长循环数无效,模板浓度高时平台期出现早，模板浓度低时平台期出现晚，应根据模板浓度调节循环数,反应程序的关键是退火温度,退火温度：提高退火温度有助于提高反应的特异性退火温度过高将导致引物与模板无法配对，影响扩增效率反应的退火温度主要取决于引物序列,三、我们能用 PCR 做什么？,自 PCR 技术创立以来，经近 20 年的发展，在基本 PCR 技术基础上产
17、生了多种 PCR 的衍生技术，应用于各种不同的目的基因克隆或亚克隆基因工程特定基因表达量的分析基因突变的检测基因诊断病原体特征性序列的鉴定基因诊断定点诱变第 4 节DNA 序列测定第 3 节,最常用的 PCR 是 RT-PCR,RT-PCR：reverse transcription PCR以 mRNA 为模板先进行逆转录，再进行 PCR为什么要以 mRNA 为模板？mRNA 无内含子，克隆的基因可在原核表达mRNA 的量代表了基因的表达水平,如何利用 RT-PCR 检测基因表达水平?,定量 PCR(quantitative PCR)PCR 产物的量与起始的模板量有关利用 PCR 对模板 DN
18、A 或 cDNA 进行定量测定定量 PCR 一般用于特定基因 mRNA 水平的检测RT-PCR 可用于基因表达水平检测需设定内部参照物(reference gene)，如：GAPDH、actin、18s rRNA 等稳定表达基因定量是相对的，一般是不准确的,为什么说 RT-PCR 定量是不准确的？,指数扩增期，产物量与模板量成正比进入平台期，产物量不能再反应模板量不同样品进入平台期的循环数不同，难以选择测定的时间节点,有精确定量方法吗？,实时荧光定量 PCR(real-time PCR)：以产物量到达一定阈值所需要的循环数为定量标准需要对 PCR 产物的生成量进行动态监控,如何进行产物量的实时
19、检测？,需要荧光标记探针与两侧 PCR 引物探针标记有报告荧光与粹灭荧光反应过程中探针被降解，报告荧光显色可通过荧光定量 PCR 仪进行实时监控,巢式 PCR 可以提高扩增效率和特异性,Nested-primer PCR内外两套引物分两轮进行扩增在克隆一些低丰度基因时可以采用,经过两轮 PCR 扩增，具有更高的灵敏度四条引物均与模板匹配，因此增加了特异性,可以利用多对引物进行多重 PCR,多重 PCR(multi-primer PCR)多组引物同时进行的 PCR，可大幅度降低 PCR 反应的工作量,可以在组织切片上进行原位 PCR,原位 PCR(in situ PCR)在组织切片或细胞涂片上进
20、行的 PCR 方法主要用于特定基因表达水平的原位分析组织切片经过固定、蛋白酶和 DNase 消化后进行 RT-PCR 扩增,Sequencing：基因结构分析的最基本方法主要方式：化学降解法酶法：Sanger 法/双脱氧链末端终止法二代/三代测序技术,第三节：基因测序,适用于寡核苷酸片段测序的方法基本反应：G：DMSG/A：哌啶T/C：肼(低盐)C：肼(高盐),一、化学降解法,Sanger 在 1977 年建立的方法，也称酶法测序DNA 序列测定的最常用方法,二、双脱氧末端终止法,在反应体系中加入 2,3-ddNTP，由于其没有 3-OH 而不能与下一个核苷酸相连，于是DNA链的合成便终止。,
21、Sanger法测序,模板：单链单双链均可酶：Klenow 耐热 DNA 聚合酶标记：同位素标记荧光标记电泳：平板电泳毛细管电泳 4 泳道单一泳道,酶法测序的自动化程度越来越高,二代测序技术(next-generation sequencing)1 天完成全基因组测序罗氏、Solexa、ABI 等公司各有不同技术利用微珠或芯片实现大通量，边合成边测序三代测序技术(next-next-generation sequencing)：3 分钟完成全基因组测序基于纳米微孔的单分子测序技术,二代测序与三代测序技术,第四节：DNA 定点诱变技术(自学）,目前主要用 PCR 方法进行定点诱变也可进行突变基于的
22、全合成,第五节：RNA 干扰技术,学习基因工程之后，在基因剔除技术部分介绍,第六节：生物芯片,生物芯片(biochip)：基于微电子技术和生物信息技术建立的高度集成化的生物样本分析方法生物芯片是后基因组时代的利器生物芯片有哪些种类？DNA microarrayProtein microarrayAntibody microarrayChemical compound microarrayTissue microarray,什么是基因芯片技术？,基因芯片(gene chip)，一种高通量的核酸杂交方法，又称 DNA 微阵列(DNA microarray)将大量探针固定与固相支持物，与标记的待测样
23、品进行杂交的方法Affymetrix 公司已经将 GeneChip 注册,如何制作基因芯片？,cDNA 芯片：cDNA 片段以显微打印的方式固定于固相支持物表面，集成度较低原位合成芯片：以激光蚀刻技术直接合成寡核苷酸探针，集成度可达 105 点阵/cm2以上,基因芯片能帮助我们干什么？,基因表达谱芯片(gene expression profile)：基因表达的大通量分析SNP 芯片(single nucleotide polymorphism)：单核苷酸多态性的大通量检测微小 RNA 芯片(miRNA)：分析 microRNA甲基化芯片：分析基因组甲基化状态ChIP-chip(chromat
24、in immunoprecipitation)：分析 DNA 与蛋白质的相互作用,芯片的主要工作流程,选择与购买芯片准备样品标记样品杂交检测杂交信号分析处理结果,第七/八节：蛋白质分析方法,蛋白质的定量分析：ELISA(Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay)Western blot蛋白质的定位：免疫组织化学荧光蛋白的活细胞定位蛋白质相互作用的研究蛋白质功能的研究蛋白质组学技术,Proteomics,蛋白质组与蛋白质组学：对特定组织细胞总蛋白的整体性研究,蛋白质组学研究的目的什么？,解读基因组：基因组编码了多少基因？蛋白表达：比研究 RNA 表达深入了一步蛋白功能
25、：超过 1/3 的蛋白质功能不明确蛋白质修饰：糖基化、磷酸化、酶解等蛋白质定位：subproteome蛋白-蛋白相互作用：互作是功能的基础,蛋白质组学的核心技术是什么？,1975 年，双向电泳技术建立1990 年，更新的 Edman 降解法用于微量蛋白质测序，灵敏度达到 pmol 级质谱技术使蛋白测序灵敏度达到 fmol 级基因组计划提供了大量的生物信息双向电泳质谱生物信息分析,等电聚焦 SDS-PAGE,双向电泳技术,双向电泳,等电聚焦SDS-PAGE,双向电泳的优点与缺陷,优点：比单向电泳有更高的分辨率缺点与解决办法：无法检测低丰度蛋白：分组检测无法检测大分子量或脂溶性蛋白：酶解电泳图谱解
26、读困难：自动化分析、DIGE,Difference gel electrophoresis(DIGE),Mass spectrometry,肽质谱(MS)：分析混合多肽只能确定氨基酸组成，不能分析序列氨基酸质谱：分析单一肽的氨基酸序列串联质谱(Tandem mass spectrometry，MS/MS)可以分析氨基酸序列通过与数据库比较确认肽的来源,MS 与 MS/MS,如何进行蛋白-蛋白相互作用的分析？,酵母双杂交(yeast two-hybridization)噬菌体展示文库(phage display library)免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)FRET(
27、Fluorescence Resonance Energy Transfer),Yeast two-hybridization,蛋白质相互作用的筛查方法以特定蛋白为钓饵，筛选其相互作用蛋白,如何利用蛋白质组学方法进行功能分析？,蛋白质芯片抗原抗体鉴定蛋白质相互作用鉴定蛋白质与小分子相互作用：代谢组学检测酶活性：蛋白质功能的高通量分析,本章的主要内容是什么？,通过本章学习了解了哪些核酸和蛋白质研究方法？什么是分子杂交？分子杂交的探针是什么？怎样进行标记？分子杂交有哪些基本方式？什么是 PCR？基本原理是什么？PCR 反应体系是由什么组成的？,本章的主要内容是什么？,什么是 RT-PCR？能用来干什么？如何利用 PCR 进行核酸的定量分析？什么是基因芯片？什么是蛋白质组学？核心方法是什么？如何进行蛋白质相互作用的研究？,
