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1、分子生物学常用技术,第十七章,分子生物学常用技术,凝胶电泳 分子杂交 聚合酶链反应(PCR)技术 DNA的物理图谱 DNA序列测定 基因芯片,第一节 凝胶电泳(gel electrophoresis),电泳概念基本原理 Q 6r : 迁移率 Q : 电荷量 r : 粒子半径（分子量） : 介质粘度,电泳的用途分离鉴定纯度测定分子量凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳,一、琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis),分离核酸原理 操作要点 应用范围,（一）分离核酸原理,电荷效应 分子筛效应 分子构象,1. 电荷效应,核酸是两性电解质 pH = 3.5 ,
2、 正电荷 pH = 8.08.3 , 负电荷，正极,2.分子筛效应,小分子移动快 ，大分子移动慢,3. 分子构象,闭环超螺旋线状DNA开环DNA,+,-,（二）操作要点,支持物 凝胶浓度的选择 DNA分子量标准 电泳缓冲液 样品制备 电泳条件 DNA电泳染色 DNA片段的回收,1. 支持物,商品化的琼脂糖,琼脂糖种类,2. 凝胶浓度的选择,凝胶的制备,3. DNA marker,DNA marker,DNA 长度标准曲线,4. 电泳缓冲液,Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 Tris-磷酸(TPE) pH 8.0,5. 样品制备,上样缓冲液 50%甘油
3、/蔗糖 0.5%溴酚蓝/二甲苯青,点 样,6.电泳条件,潜水电泳 恒压电泳 低压: 12V/cm 中压: 810V/cm 高压电泳：几十V/cm温度：1525,潜水电泳,7.电泳染色,溴乙锭(ethidium bromide, EB) 结构及染色原理 染色方法加入凝胶液中 电泳结束后染色,EB染色原理,紫外灯下显色,8. DNA片段的回收,低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法(5kb) DEAE-纤维素膜法(0.55kb),（三）应用范围,DNA的分离、纯化和鉴定 限制性酶切图谱分析 重组体的分离、鉴定 杂交分析 PCR产物的分离鉴定,琼脂糖凝胶电泳,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylami
4、de gel electrophoresis, PAGE),分离原理 操作要点 优点 应用范围,（一）分离原理,电荷效应 分子筛效应,PAGE支持物,单体丙烯酰胺(Acr) 交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis) 催化剂过硫酸胺(AP) 加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED),聚丙烯酰胺凝胶,（二）操作要点,凝胶的分类 凝胶浓度的选择 凝胶液的配制 凝胶中DNA的检测DNA片段的回收,1. 凝胶的分类,非变性凝胶：dsDNA变性凝胶: ssDNA尿素甲酰胺SDS,2. 凝胶浓度的选择,3. 凝胶液的配制,PAGE装置,电 泳,4. 凝胶中DNA的检测,溴乙锭染色法 银盐染色法 甲醛 还原放射
5、自显影法,Ag+DNA,Ag（黑褐色）,5.DNA片段的回收,压碎浸泡法 1kb 纯度高，回收率低,（三）PAGE优点,机械强度好、化学稳定性高分辨率高 载样量大 回收的DNA纯度高,（四）PAGE应用范围,分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA DNA序列分析 PCR产物鉴定 蛋白质的检测和分析,第二节 分子杂交,分子杂交的基本原理固相支持物探针几种常用杂交技术,一、分子杂交的基本原理,核酸的变性和复性,分子杂交,DNA-DNA,DNA-RNA,杂交条件,靶分子 探针 杂交袋 杂交炉,杂交种类,被检核酸种类和方法 原位杂交斑点杂交Southern杂交Northern杂交Western杂交 反应
6、介质 液相杂交 固相杂交(),二、固相支持物,固相支持物的特性结合能力强不影响杂交反应结合牢固 非特异性吸附少 机械性能良好,固相支持物的种类,硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter membrane) 尼龙膜(nylon membrane),1.硝酸纤维素滤膜,特点吸附ssDNA和RNA 杂交信号本底低 不足不适于重复杂交滤膜较脆 不适于电转移印迹法 对DNA小片段(200bp)结合能力弱,2. 尼龙膜,特点结合能力强 可反复杂交 韧性强 适于电转移印迹法对DNA小片段(10bp)结合能力强 不足杂交信号本底较高,分子生物学考试,时间：2005.1.11(晚7:00-9
7、:00) 地点 9教讲演厅 (150人) 9-2-1 (50人) 9-2-2 (50人) 9-3-1 (50人) 答疑：1.10 (9:00-11:30; 3:00-5:30) 地点：逸夫楼3楼生化实验室,三、探针(probe),探针的概念探针的类型 标记物的种类标记方法,1. 探针的概念,特异结合和检测靶分子的活性物质抗原抗体配体受体同源DNA/RNA,2. 探针的类型,基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 蛋白质或多肽探针,3. 标记物的种类,放射性同位素(32P, 3H, 35S, 125I, 14C) 非放射性标记物生物素地高辛荧光素酶,4. 核酸探针的放射性标记方
8、法,DNA缺口平移标记法 随机引物标记法 DNA的5末端标记,缺口翻译,特点均一标记制备dsDNA探针,随机引物标记法(random priming),随机引物6nt含有各种可能的排列顺序特点放射比活性缺口翻译 操作简便 DNA/cDNA 探针,DNA的5末端标记(5end labeling),碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶 标记原理 制备寡核苷酸探针 制备短的DNA/RNA探针,DNA的5末端标记,四、Southern 杂交,Southern blotting/DNA blotting1975年，Edwen Southern等印迹(blotting) : 转移 blot: a spot or m
9、ark, esp. of ink blotting,1. 印迹的方法,毛细管转移法 电转移法 真空转移法,毛细管转移法,电转移法,真空转移法,2. Southern 杂交的步骤,3. Southern 杂交的应用,基因的定性及定量分析基因的酶切图谱分析基因突变分析 RFLP,五、Northern 杂交,RNA blotting 步骤 总RNA/mRNA变性电泳分离转移杂交放射自显影/化学显色 应用检测组织/细胞中mRNA的大小、量 比较不同组织/细胞中基因的表达情况,Northern 杂交,六、Western 杂交,免疫印迹(immunoblotting) SDS-PAGE转移蛋白第一抗体标记
10、的第二抗体(探针)检测 应用-蛋白质的定性定量分析,免疫印迹,Southern,Northern & Western,七、原位杂交(in situ hybridization),定义种类细胞内原位杂交组织切片原位杂交 基本程序 细胞/组织固定预杂交杂交冲洗 杂交信号检测 分析结果,组织切片,八、斑点杂交(dot hybridization),第三节 PCR技术,聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR)PCR的发展简史PCR的基本原理和步骤PCR的影响因素PCR的种类PCR的应用,一、PCR的发展简史,1971年,Korana提出核酸体外扩增的设想 1985
11、年, Mullis 等发明了PCR技术 1988年, PE-Cetus公司推出了第一台PCR仪,二、PCR的基本原理和步骤,基本原理DNA复制 三个步骤变性(denaturation) 退火(annealing) 延伸(extension),PCR的原理,PCR的扩增产物,标准的PCR反应体系,10X 扩增缓冲液： 10ul 模板DNA: 0.12ug 引物： 各0.21umol/L 4种dNTP: 各200umol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶： 2.5U 总体积： 100ul,三、PCR的影响因素,模板 引物 Taq DNA聚合酶 4种dNTP Mg2+ 循环条
12、件,模板,DNA RNAcDNA 对模板的纯度要求低,引物,长度：1530nt G+C含量：4060% 碱基的随机分布 避免引物自身和引物之间的互补 引物的3端 引物的5端 引物浓度：0.21umol/L,Taq DNA聚合酶,2.5U/100ul 20保存 最后加,底物,4种dNTP 的浓度相等终浓度：200umol/L,Mg2+,浓度: 1.52.0mmol/L 过高: 非特异扩增 过低 : 反应产物减少,循环条件,变性温度和时间: 9096, 3060s 退火温度和时间: 4060, 3060sTm=4(G+C)+2(A+T) 延伸温度和时间7075 (72 )1kb, 1min; 34
13、kb , 34min; 10kb,15min循环次数: 2535,四、PCR的种类,反转录PCR原位PCR(in situ PCR)实时PCR(real time PCR)重组PCR(recombinant PCR)锚定PCR(anchored PCR)反向PCR(inverse PCR),原位PCR,原位杂交PCR程序 固定细胞/组织样品PCR前处理PCR扩增原位杂交及检测,实时PCR的原理,五、PCR的应用,分子生物学研究临床医学,分子生物学研究,基因克隆 DNA序列测定基因的体外定点突变 突变分析(PCR-SSCP) 基因定量,临床医学,病原体诊断 遗传病的基因诊断 肿瘤检测 法医学,第
14、四节 DNA序列测定,Sanger 双脱氧链终止法(1977) Maxam-Gilbert化学裂解法(1977),Sanger 双脱氧链终止法,原理DNA复制 反应条件 模板引物 dNTP（其中一种带放射性标记） ddNTP DNA聚合酶,DNA的复制,2,3-双脱氧核苷酸(ddNTP),DNA测序操作,DNA自动测序,DNA自动测序仪,第六节 生物芯片(Biochip),20世纪90年代末生物分子之间相互作用的特异性种类 细胞芯片、组织芯片、微生物芯片、基因芯片、蛋白质芯片,基因芯片,概念 种类 应用领域 表达谱基因芯片及其检测原理 应用举例,什么是基因芯片？,基因芯片(Gene chip,
15、 DNA chip),又称为DNA微阵列(DNA Microarray)，是指固定在载体上的高密度DNA微点阵。具体地说就是将大量寡核苷酸或cDNA有序地、高密度地排列在玻璃、硅等固相载体上。,基因芯片,芯片的制备,基因芯片的种类,表达谱基因芯片 诊断芯片 检测芯片,基因芯片的应用领域,基因芯片,基因表达谱,疾病诊断,药物筛选,新基因寻找,测序,基因分型,基因突变,表达谱基因芯片及其检测原理,研究在不同组织或细胞、不同发育阶段中基因的表达差异，进而阐明基因的功能,检测原理,表达谱基因芯片,应用举例,用基因表达谱芯片研究人正常和肝细胞癌中差异表达的基因 肿瘤的分型及预测 1999年，Gulop等 急性白血病的分型 AML(13/10) ALL(25/24),
