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1、代谢组学技术及其在医学研究中的应用,系统生物学（systems biology）是研究一个生物系统中所有组成成分（基因、mRNA、蛋白质等）的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互关系的学科。,在后基因组(post-genome)时代, 系统生物学研究逐渐成为人们关注的焦点。系统生物学研究的目的是根据细胞内基因、蛋白质、代谢物以及细胞器等组分间的时空相互关系构建生物网络, 了解生物行为。,一些组学研究技术的发展极大地推动了系统生物学的研究, 比如转录组学（transcriptomics）、蛋白质组学（proteomics）等功能基因组学（functional genomics,与结构基因组学s
2、tructural genomics相对 )研究方法可同时检测药物、疾病、环境或其它因素影响下大量基因或蛋白质的表达变化情况, 但这些变化往往不能与生物学功能的变化建立直接联系。代谢组学(metabonomicsmetabolomics)方法则可为代谢物含量变化与生物表型变化建立直接相关性。,代谢组(metabolome)是指一个细胞、组织或器官中所有代谢物的集合, 包含一系列不同化学型的分子, 比如肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等。代谢组学(metabonomicsmetabolomics)来源于代谢组一词,是研究一个细胞、组织或器官中所有小分子代谢组分集合的科学。代谢组学
3、研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量。,代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官的生化状态, 协助阐释新基因或未知功能基因的功能, 并且可以揭示生物各代谢网络间的关联性, 帮助人们更系统地认识生物体。进行代谢组学研究涉及生命科学、分析科学以及化学统计学三大方面的专业知识。 代谢物化学分析技术及数据分析技术的发展极大促进了诸多生物、医学问题的研究, 这些知识的综合运用使得代谢组研究在疾病诊断、药理研究以及临床前毒理等研究中发挥了极为重要的作用。,1 代谢组学分析实验设计及样品制备,代谢组学是一种大规模研究技术,对于研究外源性物质(药物或毒物)刺激、环境变化或遗传修饰引起的机体所有代谢物
4、变化过程是很有效的, 比如寻找疾病生物标志物用于早期诊断。但对于研究特定种类的代谢物, 这种大规模研究平台的灵敏度则不如传统的技术手段。,进行代谢组分析, 首先需要进行样品的提取。对于组织和细胞培养液, 水相和有机相代谢物可以很容易地被提取。实际上, 不论各种代谢物在体内参与何种代谢过程, 通过相应抽提程序, 所有的胞浆以及膜代谢物均会被提取出来。样品制备过程的不一致性导致结果重复性较差。因此, 为最大程度减小操作对代谢组数据产出的影响, 人们应严格遵循一套标准的提取程序(Standard Operating Protocols, SOPs)。,2 代谢组学化学分析技术,代谢组研究需要比较复杂
5、的分离、鉴定方法, 到目前为止, 应用的方法主要包括核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR)、电喷雾电离质谱(electrosprary ionization mass spectrometry, ESI-MS)、液相色谱-紫外光谱-质谱联用(liquid chromatography ultraviolet massspectrometry, LC-UV-MS)、串联质谱(tandem massspectrometry, tandem MS)以及液相色谱-质谱联用(liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS)等
6、。,1946年，美国哈佛大学的珀塞尔和斯坦福大学的布洛赫宣布，他们发现了核磁共振。两人因此获得了1952年诺贝尔奖。核磁共振是原子核的磁矩在恒定磁场和高频磁场（处在无线电波波段）同时作用下，当满足一定条件时，会产生共振吸收现象。核磁共振很快成为一种探索、研究物质微观结构和性质的高新技术。目前，核磁共振已在物理、化学、材料科学、生命科学和医学等领域中得到了广泛应用。,核磁共振仪器组,早期核磁共振主要用于对核结构和性质的研究，如测量核磁矩、电四极距、及核自旋等，后来广泛应用于分子组成和结构分析，生物组织与活体组织分析，病理分析、医疗诊断、产品无损监测等方面。用核磁共振法进行材料成分和结构分析有精度
7、高、对样品限制少、不破坏样品等优点。,对于孤立的氢原子核（也就是质子），当磁场为1.4T时，共振频率为59.6MHz，相应的电磁波为波长5米的无线电波。但在化合物分子中，这个共振频率还与氢核所处的化学环境有关，处在不同化学环境中的氢核有不同的共振频率，称为化学位移。这是由核外电子云对磁场的屏蔽作用、诱导效应、共厄效应等原因引起的。同时由于分子间各原子的相互作用，还会产生自旋-耦合裂分。利用化学位移与裂分数目，就可以推测化合物尤其是有机物的分子结构。这就是核磁共振的波谱分析。,ATRP 聚酯大分子引发剂的300M核磁共振氢谱,核磁共振波谱查询数据库,系统数据库包含化合物核磁共振氢谱6万多张，核磁
8、共振碳谱4万多张可通过光谱编号、原子数、分子式进行查询，结果得到所要查询化合物的有关信息及其标准谱图系统程序还允许用户将本研究领域一些常用化合物的标准谱信息和图谱添加进数据库以供日后查询,最早的核磁共振成像实验是由1973年劳特伯发表的，并立刻引起了广泛重视，短短10年间就进入了临床应用阶段。人体组织中由于存在大量水和碳氢化合物而含有大量的氢核，一般用氢核得到的信号比其他核大1000倍以上。正常组织与病变组织的电压信号不同，结合CT技术，即电子计算机断层扫描技术，可以得到人体组织的任意断面图像，尤其对软组织的病变诊断，更显示了它的优点，而且对病变部位非常敏感，图像也很清晰。,质谱分析(mass
9、 spectrometry, MS)是一种测量离子荷质比（电荷-质量比，charge-mass ratio）的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。,第一台质谱仪是英国科学家弗朗西斯阿斯顿于1919年制成的。出手不凡，阿斯顿用这台装置发现了多种元素同位素，研究了53个非放射性元素，发现了天然存在的287种核素中的212种，第一次证明原子质量亏损。他为此 荣获1922年诺贝尔化学奖。,质谱仪种类非常多，工
10、作原理和应用范围也有很大的不同。从应用角度，质谱仪可以分为下面几类：有机质谱仪： 气相色谱-质谱联用仪（GC-MS） 液相色谱-质谱联用仪（LC-MS） 其它有机质谱仪，主要有：基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI-TOFMS），富立叶变换质谱仪（FT-MS）无机质谱仪： 火花源双聚焦质谱仪 ( SSMS ） 感应耦合等离子体质谱仪（ICP-MS） 二次离子质谱仪（SIMS）,基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）,A FT-ICR mass spectrometer,傅立叶变换离子回旋共振质谱仪,质谱仪的基本结构及工作流程,单聚焦质谱仪示意图,氰戊菊酯的结构及其质谱
11、图,近来, 两种新质谱技术傅立叶变换回旋共振质谱(Fourier transform ion cyclotron resonancemass spectrometry, FTICR-MS)和毛细管电泳质谱(capillary electrophoresis mass spectrometry, CE-MS)被用于代谢物图谱分析。FTICR-MS 具有高通量的优点, 可检测上千种代谢物, 但不能区分异构体限制了它的应用; CE-MS 检测灵敏度较高, 可以检测低丰度代谢物, Soga 等利用CE-MS 在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中检测到一千多种代谢物。,质谱谱图数据库收
12、录了大部分常用化合物的质谱数据，检索途径为质荷比检索，丰度检索以及组合检索，可获取化合物质谱谱图，物化性质等信息。,高效液相层析High performance liquid chromatography 70年代新发展的层析法。其特点是：用高压输液泵，压强最高可达34个标准大气压。用直径约310微米的超细支持物装填均匀的不锈钢柱。这种支持物能承受很高的压力，化学性能稳定。用不同类型支持物的HPLC，可做吸附层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。其分析微量化可达10-10克水平。但用于制备，可以纯化上克的样品。展层时间短，一般需几分钟到10余分钟。其分析速度、精确度可与气相层析媲美。HPLC适于分
13、析分离不挥发和极性物质。而气相层析只适用于挥发性物质，两者互为补充，都是目前最为理想的层析法。HPLC在生物化学、化学、医药学和环境科学的研究中发挥了重要作用。,HPLC图谱,Liquid chromatography-mass spectrometry,气相色谱,气相色谱法是指用气体作为流动相的色谱法。由于样品在气相中传递速度快，因此样品组分在流动相和固定相之间可以瞬间地达到平衡。另外加上可选作固定相的物质很多，因此气相色谱法是一个分析速度快和分离效率高的分离分析方法。近年来采用高灵敏选择性检测器，使得它又具有分析灵敏度高、应用范围广等优点。,gas chromatography,1.乙醛
14、2.甲醇 3.乙醇 4.正丙醇 5.乙酸乙酯 6.仲丁醇 7.异丁醇 8.乙缩醛 9.正丁醇 10.乙酸 11.异戊醇 12.丁酸乙酯 13.丙酸 14.乳酸乙酯 15.丁酸 16.己酸乙酯,白酒分析：GC,A gas chromatograph (right) directly coupled to a mass spectrometer (left),乙氧氟草醚GC-MS质谱图,采用何种分析技术主要取决于待分析生物系统的种类以及要解决何种科学问题。NMR 可以快速、无损伤性地进行代谢物的体内(in vivo)或体外(in vitro)比较分析。直接应用MS进行代谢物分析虽然速度也较快, 但
15、具有灵敏度以及分辨率较低的缺点。将MS与GC或LC联用(GC-MS 或LC-MS), 虽然降低了分析速度, 但却提高了分析灵敏度以及分辨率。而且基于质谱的分析技术已长期用于代谢物指纹图谱分析,具有比较成熟的样品制备、数据采集以及分析等操作程序。,3 代谢组学数据采集与分析,与转录组、蛋白质组研究一样, 代谢物可以通过与对照样品的比值进行相对定量。通过添加标准参照物以及对代谢物进行同位素标记, 可以获得绝对定量的代谢组数据集。此外, 数据采集的重复性以及采用何种数据处理方法对代谢组分析结果的影响很大。,一旦获得代谢组的定量数据集, 可以采用已在转录组、蛋白质组分析中得到应用的多种数据分析策略进行
16、代谢组数据分析, 这些分析策略的基本原则是比较实验组与对照组之间代谢物水平差异,并利用统计方法评估这些差异的显著性。,代谢组数据的分析离不开化学统计学的应用。在利用NMR 和MS 进行的代谢组学研究中, 化学统计学是指利用数学或统计工具进行光谱处理、峰比对、异常值检测以及数据均一化等。多变量分析是分析代谢组研究产出的复杂数据的一种有效方法, 其中PCA(principal component analysis，主成分分析)是一种将原始特征压缩至最小可能性成分数的维数缩减方法, 即用较少的综合性变量代替原来众多的相关性变量, 使有关的研究简化。PCA 已成为代谢组研究中最常规的分析方法。,此 外
17、 ,偏最小二乘法(partial least squares method，PLS) 、独立成分分析(independent component analysis)、正则相关系数(canonical correlation)、对比分析(correspondence analysis)、贝叶斯模型(Bayesian modeling)以及隐含马尔可夫模型(hidden Markov models)等也是代谢组分析中常用到的模型分析方法。,人类代谢组学标准物质数据库,基于GC-MS的代谢组分析已被广泛的应用于发现药物或除草剂的作用模式和在生物技术中辅助揭开基因序列对代谢组和生命机能的影响。而建立代
18、谢谱的前提和关键是从复杂的样本（例如血浆，细胞提取液，复杂植物动物样本）中快速，可靠，准确的识别大量的代谢物。,GC-MS数据的定性分析传统上主要依靠相似度匹配，因此有人建立了专门的代谢组学质谱数据库。如中南大学化学化工学院中药现代化研究中心参考David S. Wishart等建立的人类代谢组学数据库（www.hmdb.ca），建立了人类代谢组学GC-EIMS 标准物质数据库。,该数据库主要参考人类代谢组学数据和文献提供的血浆，尿液，唾液，胆汁，脑髓液和呼出气体中代谢物的信息， 通过参考NIST 质谱数据库（webbook.nist.gov/chemistry），查阅整理文献，标准物质直接进
19、样和运用质谱知识预测得到。,4 代谢组学的研究过程,代谢组学研究一般包括四个步骤：第一步，给予生物体一定的刺激。这种刺激可以是基因的变异、剔除或引入，体内生物过程的催化或抑制，致病或致病物质(无机、有机、病毒、细菌、寄生虫等等)的引入，以及各种环境因素的改变等等。第二步，代谢组数据的采集。用核磁共振、质谱、色谱等分析手段测定其中代谢物的种类、含量和状态以及其变化。,第三步，建立表征代谢特征的时空模型。在代谢组学中最常用的建模方法是主成分分析(Principle Components Analysis, PCA)。其基本思路是以一种最优化方法浓缩数据，寻找几个由原始变量线性组合而成的主成分,以揭
20、示原始数据的特征，提取基本信息，实现对数据的可视化和样本的分类聚集。第四步，建立代谢物时空变化与生物体特性的关系，达到从不同层次和水平上阐述生物体对相应刺激的响应的目的。,5 代谢组学的应用,5.1 代谢组学在肝病研究中的应用,代谢组研究的一个重要部分是比较分析健康状态与疾病状态下小分子代谢物表达的差异, 这有助于人们寻找各种疾病早期诊断的生物标志物（biological marker）, 并可用于疾病预后及治疗效果的评判。肝脏是机体内负责能量合成和物质代谢的中心器官, 各种肝脏疾病严重威胁人类健康, 对肝病进行研究很有必要,代谢组学技术为肝病的诊断、机制研究等提供了一个比较好的技术平台。,Y
21、ang等利用LC-MS和偏最小二乘法差异分析法(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)鉴定到5个慢性乙型肝炎引发的急性肝衰的诊断标志物（diagnostic markers）, 其中羟鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid, GCDCA)是传统标志物,而另外4个则是新鉴定到的诊断标志物。,半乳糖胺(galactosamine, galN)是一种经典的肝毒素, 已被广泛的用于肝损伤实验研究中。Feng等用galN结合脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)造成BALB/c 小鼠突发性肝损伤
22、(fulminant hepatic failure, FHF), 然后利用气相色谱飞行时间质谱联用技术(gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry, GC-TOF-MS)和PCA 对FHF 的代谢图谱进行了研究, 结果表明血浆中的5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxylindoleacetic acid) 、- 羟基丁酸(-hydroxybutyrate) 以及磷酸盐的浓度变化可作为FHF 的早期诊断标志物。,5.2 代谢组学在肿瘤研究中的应用,近来的研究表明, 不同肿瘤制备样品(比如培养细胞、组织切片、体内肿瘤块等)的代谢图谱与肿瘤
23、类型、增殖、代谢活性以及细胞死亡有较强的相关性。对肿瘤代谢表型图谱的研究有助于人们了解肿瘤发生、发展以及致死的机制; 在临床条件下, 这些代谢图谱可以作为肿瘤诊断、预后以及治疗的评判标准。,Yang等利用1H MAS NMR和PCA研究表明人轻度肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)及重度肝癌与毗邻的正常肝组织在代谢物表达上有显著差异, 且轻度肝癌与重度肝癌之间也有显著差异,这对于肝癌的早期诊断很重要。 此外, 代谢组技术已应用于脑瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等引发的代谢物变化的体内检测。,5.3 代谢组学在其他疾病研究中的应用,近年来代谢组技术在疾病诊断、机制及治
24、疗等方面中的研究越来越受到人们的重视。除在肝病、肿瘤等方面的应用外, 该技术在其他疾病研究领域也得到应用, 比如Paige 等利用GC-MS 研究表明, 老年抑郁症可能与脂类、神经递质等的代谢改变有关; Weljie 等利用1H NMR对转基因风湿性关节炎小鼠进行了研究。,此外, 在肾病、高血压、II型糖尿病、心血管病、炎症性肠病、哮喘、脑膜炎以及精神分裂症等多种疾病研究中, 代谢组技术也已得到广泛应用。除在疾病诊断中发挥作用外, 代谢组学技术也已被用于机体健康状况的评价, 特别是营养水平对健康的影响。,5.4 代谢组学在毒理学中的应用,在毒理学研究中, 评判组织损伤的“金标准”是进行组织病理
25、学检测, 这种检测并不提示分子方面的信息。此外, 由于组织病理学检测往往依赖于病理检测人员的经验, 这种检测具有一定的主观性,可提供定性信息, 而不能提供定量信息。代谢物组成的变化是毒物胁迫对机体造成的最终影响, 利用代谢组技术可以直接反映毒物对机体的影响。,它莫西林(tamoxifen, TMX)是一种常用的抗乳腺癌药物, 可引发非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH), Lelliott 等利用NMR与转录组技术相结合进行研究, 结果表明TMX作用通过降低脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)的表达及活性严重影响了肝
26、脏内脂肪代谢, 为NASH的形成及相关代谢紊乱提供了一种新的解释。,代谢物组成的改变可以直接或间接地反映在流经受损器官的血液中,进而经过肾脏过滤后, 这种改变还可反映在尿液中。采集机体尿液或血液, 利用代谢组技术分析毒物作用后代谢物组成变化, 可以无损伤性的评估目标器官的受损程度。,Robertson等利用NMR以及PCA研究了两种肝毒剂四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)、-萘异硫氰酸(-naphthyliso-thiocyanate,ANIT)和两种肾毒剂2-溴乙胺(2-bromoethylamine,BEA)、对氨基苯酚(4-aminoohenol, PAP)对
27、Wistar大鼠尿液代谢物组成的影响, 结果表明利用代谢组技术可以快速进行毒剂的体内检测。,5.5 代谢组学在药物研发中的应用,在药物研发过程中, 确定候选药物的药物代谢动力学、代谢特性以及毒副作用等是必需的, 药物代谢物质的检测、鉴定已经成为药物研发的首要任务。传统的药物代谢物质检测、鉴定过程比较耗时费力, MS、NMR技术的应用使得这一过程可以快速完成, 并能鉴定低丰度的药物代谢物质。,对候选药物进行大规模筛选需要多家机构进行科研合作, 在这方面, 5家大制药公司和伦敦帝国学院(Imperial College London)发起成立了毒物代谢组联盟(Consortium for Meta
28、bonomic Toxicology, COMET)计划, 该联盟开发新的代谢组数据采集、分析方法, 利用1H NMR对大鼠和小鼠尿液、血清进行代谢物分析, 对候选药物进行临床前毒副效应研究。COMET可以评估分析仪器以及生物体的差异对结果的影响, 提高结果的可重复性, 其最终目的在于建立药物毒副作用的专家预测系统, 并对种属间药物毒性差异进行研究。,药物基因组学(pharmacogenomics)研究的一个长期目标是了解遗传差异(基因多态性)导致不同个体间药物代谢能力的差异, 以及药物在不同个体间作用效果及副作用的差异, 从而实现根据个体情况进行个体化用药。新近出现的药物代谢组学(pharm
29、acometabonomics)也能帮助人们了解不同个体对药物作用反应的差异, 这种研究方法对遗传差异和环境影响都很敏感, 通过对代谢物变化进行分析能很好的揭示这些差异。,5.6 代谢组在酶功能研究中的应用,利用RNAi、基因敲除等遗传策略结合细胞、生物体表型分析, 可以有效分析酶在生理病理条件下的功能。然而, 这些策略不能用于进行内源性酶生化功能的整体分析。此外, 由于体内存在蛋白质相互作用网络、蛋白质翻译后修饰以及人们目前对酶与底物相互关系认识不足等原因, 传统的体外酶功能研究方法也不适用于体内酶功能整体分析。代谢组学研究方法可以克服上述这些困难,对代谢网络中的酶功能进行有效的整体性分析。酶通过催化特异底物生成产物调节生物变化过程, 鉴定内源性底物可推知体内酶的功能。,6 代谢组学的发展趋势,代谢组学是一个全新的研究热点。这主要表现在：第一、代谢组学的研究论文数正在以指数方式增长；第二、高影响因子(8.0)学术刊物上发表的论文数量较多；第三、核心论文引用率高，如有的单篇引用接近240 次；第四、研究范围广泛并不断增加，涉及到功能基因组学、营养学、病理学、药理学、毒理学、植物学、微生物学以及系统生物学等众多领域；第五、仪器和分析技术的快速发展为代谢组学的进步提供了更加广阔的空间。,
