一、免疫沉淀类试验ppt课件.ppt

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1、第一部分 免疫沉淀类实验,微生物与免疫教研室,一、抗原抗体制备技术,抗体：是B淋巴细胞接受抗原激活后增殖分化为浆细胞所合成分泌的一类能与相应抗原特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。单克隆抗体：由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体。多克隆抗体：由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。,抗体制备分三个阶段,抗原的制备与纯化1.抗原的制备与纯化动物免疫2.动物的选择血清分离纯化与鉴定,抗原,抗原：是一类能够诱导机体免疫应答并能与相应抗体或T细胞受体发生特异反应的物质。具有免疫原性

2、和免疫反应性。不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。 a.根据抗原性不同，分为完全抗原和不完全抗原。 b.根据化学性质分为蛋白质抗原、类脂抗原、多糖抗原和核酸抗原。 c.根据物理性状分为颗粒性抗原和可溶性抗原。常见的颗粒性抗原主要是细菌或动物细胞。 返回,动物的选择,动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。一般，抗原来源与动物种属差异越大，免疫原性越强，免疫效果越好。免疫用的动物需选择适龄、健康、体重合适的动物，最好为雄性。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。实验室制备

3、抗体，多选用家兔和绵羊。,抗原剂量的选择,小鼠首次抗原剂量为：50-400g/次大鼠为100-1mg/次兔子为200-1mg/次加强免疫的剂量为首次剂量的1/5-2/5,途径,免疫剂量与注射途径有关，一般而言，静脉注射剂量大于皮下注射，而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射剂量大，也可采用淋巴结内注射法。,绵羊红细胞的制备流程图,摇动15-20min,4,可保存3周,取适量,NS洗涤3次2000r/min 10min,NS稀释至 25%,细菌细胞抗原的制备流程图,液体培养或 斜面培养 3724h,100水浴 45min杀菌,无菌试验,NS稀释成 10亿/ml,O菌体抗原,返回,颗粒性抗原多克隆抗体的

4、制备 -伤寒杆菌O抗血清的制备,1、伤寒杆菌O抗原的制备：,接种,37 18-24h,洗下菌苔 （用含0.5%苯 酚的NS）,100 45min,离心,4000rpm,10min,得到原液,稀释,109/ml应用液,2、免疫方法： 选择体重2-3kg的健康家兔，将已经稀释好的抗原按下列剂量及程序做皮内或静脉注射。第一天注射1ml，第8天注射1.5ml，第15天注射2ml，末次注射后7天颈动脉放血，测效价。,可溶性抗原多克隆抗体的制备,第一次免疫（基础免疫）,第一次加强免疫,第二次加强免疫,效价测定（双扩）,2-4周,2-3周,7天,佐剂,概念：预先与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应

5、答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质。种类：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。目前应用最多的是弗氏佐剂 。,佐剂,主要作用机制：改变抗原物理性状，延缓抗原的降解和排除，延长抗原在体内滞留的时间刺激单核-巨噬细胞系统，增强其对抗原的处理和提呈能力刺激淋巴细胞的增殖分化，从而增强和扩大免疫应答的能力,弗氏佐剂,动物实验中最常用的佐剂：弗氏不完全佐剂(incomplete Freunds adjuvant IFA) 羊毛脂 1 份 +石蜡油 5 份，混合，高压灭菌后保存。用时加热

6、融化，冷却至50左右，加抗原进行乳化处理。 弗氏完全佐剂(complete Freunds adjuvant,CFA) 弗氏不完全佐剂 10ml +卡介苗 10mg200mg 卡介苗可10010min灭活处理。,免疫乳剂制备成功的判别标准,油包水状态 鉴定方法是将乳化剂滴入4左右冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。,免疫,将制成的乳剂吸入注射器，在兔子背部及颈部皮下注射8-10点，每点约0.2ml每隔14天用初次用量的2/5的抗原于不完全抗原中，在皮下多点注射加强免疫,每点0.2ml,共加强2次.第二次加强免疫开始,在免疫后第7天用免疫双扩散法检查抗体效价.

7、,抗体的分离鉴定及保存,见教材p22-26,二、沉淀反应（precipitation）,是可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。,沉淀反应的特点,抗原为可溶性物质，如蛋白质、多糖沉淀反应分两个阶段：第一阶段、抗原抗体特异性结合第二阶段、形成可见的免疫复合物,分类,液体内沉淀试验,絮状沉淀试验,环状沉淀试验,免疫浊度测定,凝胶内沉淀试验,免疫扩散,免疫电泳,单向免疫扩散试验,双向免疫扩散试验,火箭免疫电泳,对流免疫电泳,沉淀反应,1.絮状沉淀反应（flocculation）,絮状沉淀试验是一项经典实验技术。代表试验：曾用于测定梅毒抗体的Kahn试验，现今已被更简便而敏感

8、的血清不加热反应素试验 (USR)或快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR)方法替代。,原理： 抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，受抗原抗体比例影响非常明显，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。,2.环状沉淀试验(ring precipitation),1902年，Ascoli建立的一种经典的血清学定性试验。用非常简便的技术了解待测血清内是否存在某种抗原或抗体。原理：把抗原溶液小心地加于已含抗体溶液的细试管液面上。当对应的抗原与抗体相遇，在界面处形成清晰的乳白色沉淀环。,方法评价,该试验是经典的血清

9、学反应之一，简便、快速、实用。环状试验中抗原、抗体溶液须澄清。该试验主要用于鉴定微量抗原，如法医学中鉴定血迹，流行病学用于检查媒介昆虫体内的微量抗原等，亦可用于鉴定细菌多糖抗原。(诊断炭疽的Ascoli试验)。只能定性，不能定量、敏感性较低(320mg/L)，对含有多个抗原抗体对的反应系统缺乏分辨力。方法难以推广。,3.免疫浊度测定,经典的沉淀试验有4个缺点无法克服：操作繁琐敏感度低（10100g/ml）时间长难以自动化,（1）免疫浊度分析的基本原理：,抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物(19S)，使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量

10、增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。用一系列已知浓度的抗原标准品同时进行试验，制备剂量反应曲线，即可计算出标本中抗原的含量,（2）类型,透射免疫比浊法散射免疫比浊法免疫胶乳比浊法,透射免疫比浊法,原理： 抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物(IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。,方法评价：,优点： 灵敏度比单扩法高510倍； CV小于10；

11、 操作简便快速，1h可报告结果； 结果准确，且能用全自动化或半全自动化仪器进行分析，尤其随着胶乳粒子增强浊度测定法的出现，使敏感度提高，其应用更加广泛。,缺点：抗体用量较大；检测需抗原抗体反应达到平衡，耗时较长；不宜用于药物等半抗原的测定；灵敏度较散射比浊法低。,散射免疫比浊法,原理： 散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散射比浊法(rate nephe

12、lometry)和终点散射比浊法(endpoint nephelometry)。,免疫胶乳比浊法,原理 选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。,（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线；（b）结合后，则形成光线衰减,方法评价,敏感度高，试剂稳定，因反应液中无PEG沉淀剂的影响，个体IC对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。,总评价,缺点： 测定结果与仪器

13、的性能和试剂的质量密切相关，特别对抗体的质量要求高，仪器和试剂价格比较贵。,优点：自动化快速(3060s)灵敏(g/L)准确精密度高(CV5)稳定性好节省试剂检测范围广不需减去样本和试剂本底值等优点。,免疫比浊测定的影响因素,抗原抗体比例抗体的质量抗原抗体反应的溶液增浊剂的使用,抗原抗体比例,高剂量钩状效应（high dose hook effect )海德堡（heidelberger）曲线理论,抗体的质量,（1）特异性高（2）效价高（3）亲和力高（4）抗血清来源,抗原抗体反应的溶液,H 6.58.5电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）,增浊剂的使用,PEG、tween-20等非离子型亲水剂

14、作用：消除蛋白质分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。,三、凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation),主要是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散(gel diffusion)。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。,根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀验分为2类：（一）免疫扩散 单向免疫扩散试验 (single gel diffusion test) 双向免疫扩散试验 (double gel diffusion test)（二）凝胶免疫电泳(gel immuno-electrophoresis),火箭免疫电泳,对流免疫电泳,（一）单

15、向免疫扩散试验,原理：将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为1.25mg/L。,操作步骤,1.将抗体和0.9%琼脂糖50-56混合,即刻倾注成平板。2.待凝固后在琼脂板上打孔,孔中加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶液。3.置37,让其向四周自由扩散,24-48h后可见其孔周围出现沉淀环。,单向辐射状免疫扩散上排为5个不同的参考，中、下排为患者血清，下排右2为一异常病理血清,影响因素,1. 抗原分子量 抗原分子量大

16、，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。 2. 抗体种类 实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血清可测抗原0.11IU/ml，马抗血清为110IU/ml，羊为0.44IU/ml，为提高实验敏感度，应首选敏感度高的抗血清。,3. 抗体稀释度 抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度。下图为抗体分别以1:25、1:50、1:75、1:100稀释，所

17、形成的4条标准曲线。,（二）双向琼脂扩散试验,1.原理： 将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩散速率等有关。,2. 操作步骤,1）融化琼脂，浇板 每张载玻片约5-6ml。2）凝固，打孔 孔径3mm，孔间距35mm，孔型有双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔型。3）加样 在相对孔内加抗原或抗体。4）孵育 使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的纯度、浓度和扩散速度有关。,3. 双向免疫扩散试验的应用,

18、1） 检测未知抗原或抗体及其相对含量 将已知的抗体或抗原与待检标本加入成对孔中，见图 :根据沉淀线有无定性；根据沉淀线的位置估计抗原或抗体的相对含量根据沉淀弧形状判断抗原或抗体的相对扩散速率。,沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系,A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；D：扩散率近似，浓度Ag Ab ；E：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab ；F：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab,2）抗原性质分析,利用三角孔型，将待检抗原和标准抗原加入相邻两个孔中，与另一孔相对，根据沉淀线形状分析待测抗原，见图 。,A1：

19、待检抗原；A2：标准抗原,3） 抗体效价滴定,用梅花型孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的效价。,4） 抗体或抗原纯度鉴定,用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原，出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯，出现多条说明不纯。,双扩散试验优缺点,优点：简单易行，用途广泛缺点：技术灵敏度低，出现结果慢，不能精确定量。,本次实验内容,实验一、双向免疫扩散试验 LDL多抗鉴定及效价测定实验二、对流免疫电泳AFP检测,实验一 双向免疫扩散试验 LDL多抗鉴定,一、实验目的1.掌握可溶性抗原制备抗血清鉴定的常用方法。2.掌握双向免疫扩散试验方法。3.掌握抗体效价的判断。,

20、二、实验原理： 双向免疫扩散（double agar diffusion）是一种定性试验。 将抗原、抗体分别加入琼脂板相对应的小孔中，使两者互相扩散，在比例适当处形成可见的沉淀线。 观察沉淀线的位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析，常用于抗原和抗体的纯度鉴定。此法亦可用于免疫血清抗体效价测定。,三、材料和试剂,1. 待测血清：兔抗人LDL抗体2. 已知抗原：LDL3. 其它：生理盐水、琼脂糖、载玻片、打孔器、微量进样器等。,四、实验步骤,1.制板：取一清洁载玻片，倾注3.04.0ml加热熔化的1生理盐水琼脂，均匀地浇注于玻片制成琼脂板。注意勿产生气泡，琼脂厚度约为 2mm

21、。2.打孔：待琼脂凝固后，在琼脂板上打孔，孔的排列方式如图1所示，孔径3mm，孔间距35mm。吸出孔内琼脂，将玻片或平皿底部在酒精灯焰上略微加热，或在小孔内加少量溶化的琼脂封底。,3.加样：用微量加样器吸取样品，分别加入小孔内，以注满为度，无需定量。在中心孔内加固定浓度的抗原，周围各孔内顺序加入倍比稀释的免疫血清，经过扩散后，以出现沉淀线的血清最高稀释度为其抗体效价。4.加样完毕，将琼脂板平放于湿盒内，在室温或37扩散24h后，观察结果。,实验二 对流免疫电泳,一、实验目的 1.掌握对流免疫电泳的原理。 2.掌握对流免疫电泳检测待测抗原的方法。,二、实验原理,对流免疫电泳实质上是定向加速的双向

22、免疫扩散技术。,在pH8.6的缓冲液中，蛋白质抗原带负电荷向正极泳动；而抗体大部分属于Ig，由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动，在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色沉淀线。,三、材料和试剂,1、AFP诊断血清：2、肝癌病人血清：（阳性对照）3、待检血清：人血清 4、阴性对照血清：正常人血清 5、pH8.6、离子强度0.05M巴比妥缓冲液6、离子琼脂：用巴比妥缓冲液配制。7、电泳仪 8、其他：打孔器、移液器，枪头,四、实验步骤,琼脂糖凝胶板的制备打孔、加样电泳结果观察影响结果的因素,制板、加样、打孔,用吸管吸取4ml加热溶化的琼脂糖铺在载玻片上

23、,待凝。打孔:用打孔器在琼脂板上打孔(孔距4mm),如图。加样:将待测抗原样品约10ul加在阴极侧孔内,抗血清加在阳极侧,加样时应加满小孔但不能溢出,Ab：甲胎蛋白诊断血清Ag：1、肝癌病人血清（阳性对照） 2、正常人血清（阴性对照） 3、待测血清,1,2,3,电泳,将加好样品的板置于电泳槽上，抗原孔置负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分别用四层纱布与0.05mol/L、PH8.6的缓冲液相连，接通电源。电流以玻片的宽度计算，为4mA/cm；电压以玻片的长度计算，为6V/cm；通电30-60min后，切断电源，观察结果。,五、结果和讨论,将玻片对着光，先观察AFP阳性血清孔与抗体孔之间的白色沉

24、淀线，然后再观察待检血清孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出现，如有沉淀线，则表示AFP试验阳性，否则AFP试验为阴性。如沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中37数小时或置电泳槽过夜再观察。,甲胎蛋白检测意义：,甲胎蛋白，简称AFP，是由胎儿肝细胞合成、在胎儿血清中正常存在的一种特殊蛋白。一般在妊娠后开始上升，至胎龄1620周时达到最高峰，然后逐渐下降，至胎儿娩出后1-5周完全消失。,此外，原发性肝癌、急、慢性肝炎、肝硬化也可升高。原发性肝癌患者，血清中AFP阳性率常明显升高，超过400微克/升（放射免疫定量法），甚至达1000微克/升以上或呈进行性升高。AFP的检测不仅有助于原发性肝癌的诊断，而且可以作为原发性肝癌的疗效考核标准，并可判断预后。,六、注意事项,1. 电泳时电流不宜过大，以免蛋白质变性。2. 抗原、抗体的电极方向不能放反。3. 电泳所需时间与孔间距离有关，距离越大， 电泳时间越长。4.抗原抗体浓度的比例： 当抗原抗体比例不适合时，均不能出现明显可见的沉淀线。抗原太浓太稀时都不易出现沉淀线。所以除了应用高效价的血清外，每份待测样品均可做几个不同的稀释度来进行检查。,七、思考题,1.比较双扩散免疫与对流免疫电泳这两种检测方法的优缺点2.什么是海德堡曲线？,