免疫实验课安排课件.ppt

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1、免疫学检测技术的分类,抗原抗体反应 凝集反应（试管凝集试验） 沉淀反应（双向免疫扩散试验） 酶联免疫吸附试验（ELISA） 淋巴细胞检测技术 外周血单个核细胞分离试验 小鼠腹腔巨噬细胞分离及 免疫细胞化学染色试验 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验 补体依赖细胞毒试验（CDC） 细胞因子检测技术 免疫学常用分子生物学技术,免疫学检测技术的分类 抗原抗体反应 凝集反应,实验报告书写的原则,实验题目：单核细胞分离 实验时间：2012.3.28实验目的：分离人类外周血单核细胞实验原理：由于不同细胞的密度不同，因此可利用密度梯度 离心法将不同比重的细胞分开。实验材料：试管、抗凝血实验步骤与结果：肉眼可见灰白层，

2、1ml血收获xx细胞。结果分析：本次分离细胞较正常人单个核细胞数少，可能原 因一是实验误差所致，二是该患者为白细胞减少 症。,实验报告书写的原则实验题目：单核细胞分离,实验设计的原则,研究的题目：确定研究题目是开展研究工作的首要任务。研究摘要：研究背景，要开展的主要研究（可以叙述利用什么样的方法开展研究），研究意义（本次研究的预期成果及其推动科学进步的作用）。研究内容：叙述主要开展的工作。研究方案：利用什么样的手段去解决研究内容提到的相关工作。研究的特色与创新之处：主要科学贡献。,实验设计的原则研究的题目：确定研究题目是开展研究工作的首要任,题目：XX细胞因子诱导肺癌细胞凋亡的作用及其机制研究

3、摘要：肺癌是最常见的肿瘤之一。XX与多种肿瘤的发生发展有关，但其在肺癌中的作用仍缺乏报道。本研究采用人肺癌细胞，利用流式细胞术分析XX诱导人肺癌细胞凋亡作用，通过分析Caspase3,8,12等确定XX诱导肿瘤细胞凋亡机制。本研究不仅可以进一步揭示XX抗肿瘤作用机制，也为寻找新的肺癌治疗方法提供研究基础。研究内容：1）XX在人肺癌肿瘤细胞的表达分析，确定XX表达与肺肿瘤的关系。2）检测患者血清XX水平，确定其辅助诊断肺癌的价值 研究方案：1）采用肿瘤组织切片，通过免疫细胞化学染色观察XX在人肺癌组织中的表达情况。2）采用ELISA法检测血清XX水平。研究的特色与创新之处：本研究阐述了XX与肺癌

4、的关系，并提出XX可作为肺癌的血清学诊断标志物，研究发现XX可以诱导肺癌细胞凋亡，并阐述了其作用机制。,题目：XX细胞因子诱导肺癌细胞凋亡的作用及其机制研究,实验设计考试,肿瘤患者存在多种免疫异常，请设计一个实验分析肿瘤患者体内巨噬细胞功能。主要包括 1）题目 2）研究内容 3）研究方案 4）预期结果,实验设计考试肿瘤患者存在多种免疫异常，请设计一个实验分析肿瘤,2010级五年制本科生免疫学实验课,主讲：倪维华Email:,2010级五年制本科生免疫学实验课主讲：倪维华,试管凝集测定血型抗体效价双向免疫扩散,实验内容,试管凝集测定血型抗体效价双向免疫扩散实验内容,抗原抗体反应分类,凝集反应,琼

5、脂沉淀反应,中和反应,补体结合反应,环状法,絮状法,沉淀反应,单向免疫扩散、双向免疫扩散对流免疫电泳、火箭电泳免疫电泳,反应分类,抗原抗体反应分类凝集反应琼脂沉淀反应中和反应环状法絮状法沉淀,实验原理:在试管中，颗粒性抗原与相应抗体在有适量电解质存在时，直接结合可形成肉眼可见的凝集块。,试管凝集测定血型抗体效价,实验原理:试管凝集测定血型抗体效价,实验目的,利用凝集试验判断抗体的效价效价：也称滴度，它的表示法与抗体的稀释倍数有关，一般以该抗体能与其对应的抗原发生可见反应的最高稀释度来表示。,实验目的利用凝集试验判断抗体的效价,实验材料,实验以个人为单位，物品四个人一组,实验材料名称量/组生理盐

6、水20ml0.5%压积血（RBC）8,实验步骤抗体倍比稀释。稀释好的试管中各加入红细胞0.5ml。加样后摇动试管，使红细胞与血清充分混合。37 孵育90mins后进行结果观察。,实验步骤试管号1234567抗体(血清)0.5ml0.5ml,抗体(血清)倍比稀释方法,取七只抗体稀释管，编号。每只管中先加入生理盐水0.5ml。取0.5ml血清加入第一管中，混匀后取出0.5ml加入第二管，依此类推。第7管为阴性对照，不加抗体（血清）。,0.5ml 生理盐水,1/60 1/120 1/240 1/480 1/960 1/1920 -,1/30血清,0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5,1 2

7、 3 4 5 6 7,抗体(血清)倍比稀释方法取七只抗体稀释管，编号。0.5ml,操作前清点好实验物品、器材。吸抗体与红细胞的加样器头不能混用。观察结果时不要摇动试管。,注 意 事 项,操作前清点好实验物品、器材。注 意 事 项,凝集程度判定：4：红细胞全部凝集，上清澄清，晃动时凝集物成片状分散3：红细胞绝大部分凝集，上清较澄清2，红细胞半数凝集，上清略澄清，红细胞少数凝集，肉眼可见小凝块，红细胞极少数凝集，显微镜下可见凝集：无凝集，红细胞在管底成界限清楚的小圆点阴性对照：第7管（无抗体）为阴性对照血型抗体效价的判定：肉眼可见凝集（）时血清的最高稀释度为血型抗体的效价,结果判定方法,结果判定方

8、法,预期实验结果,预期实验结果,双向免疫扩散实验,双向免疫扩散实验,双向免疫扩散,双向免疫扩散,双向免疫扩散的应用,抗体效价的判定 检测体液中各种蛋白成分,双向免疫扩散的应用 抗体效价的判定,实 验 材 料,试剂：1.5%琼脂 300ml/room抗OVA抗体 1份/组BSA 1份/组抗原(0.1mg/ml OVA) 1份/组,器材：5ml刻度吸管1支/组20l pipette 1把Tip (小)若干1.5ml EP管10个培养箱371个/室湿盒1个/室打孔器1个打孔纸样 1个,实 验 材 料试剂：器材：,实验步骤,玻片正面标记组别,用5ml吸管吸取预热的1.5%琼脂4ml,冷却后按纸样打孔，

9、每块载玻片打两组孔，加样,37,NOTE:加样时应将加样器头插入孔底，缓慢加入液体，直到孔满（约8-10ul）,1,抗OVA抗体,OVA,BSA,BSA,OVA,抗OVA抗体,实验步骤玻片正面标记组别用5ml吸管吸取预热的1.5%琼脂4,注 意 事 项,在玻片正面做好标记，玻片应水平放置。琼脂一定加热均匀后再进行铺胶。铺胶动作要快，均匀、厚薄一致。加样时样品量要适当，注意不要使样品溢出。吸抗体和抗原的枪头不能混用。,注 意 事 项在玻片正面做好标记，玻片应水平放置。,抗原抗体反应 淋巴细胞的检测技术 细胞因子的检测技术 免疫学常用的分子生物学技术,免疫学检测技术,抗原抗体反应免疫学检测技术,抗

10、原抗体反应,凝集反应沉淀反应免疫标记技术,抗原抗体反应凝集反应,抗原抗体反应的特点,1. 抗原与抗体的结合是特异性的 交叉反应2. 抗原抗体结合是可逆的 引力：氢键、疏水键、静电引力、范德华力 斥力：电子云产生的排斥力3. 抗原抗体反应可分为两个阶段 抗原抗体特异性结合阶段 可见反应阶段4. 抗原抗体的分子比例与抗原抗体结合是否呈现可见的反应现象密切相关,1. 抗原与抗体的结合是特异性的 交叉反应2. 抗原抗体结合是可逆的 引力：氢键、疏水键、静电引力、范德华力 斥力：电子云产生的排斥力3. 抗原抗体反应可分为两个阶段 抗原抗体特异性结合阶段 可见反应阶段4. 抗原抗体的分子比例与抗原抗体结合

11、是否呈现可见的反应现象密切相关,1. 抗原与抗体的结合是特异性的 交叉反应2. 抗原抗体结合是可逆的 引力：氢键、疏水键、静电引力、范德华力 斥力：电子云产生的排斥力3. 抗原抗体反应可分为两个阶段 抗原抗体特异性结合阶段 可见反应阶段4. 抗原抗体的分子比例与抗原抗体结合是否呈现可见的反应现象密切相关,抗原抗体反应的特点1. 抗原与抗体的结合是特异性的1. 抗原,抗体过剩区,抗原过剩区,等价区,抗体过剩区抗原过剩区等价区,抗原-抗体反应受多种因素影响,电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠作为稀释液 ，以供给适应浓度的电解质。温度：一般常使反应在37度水浴或孵育箱中进行。酸碱度：抗

12、原-抗体反应适应的酸碱度为PH68。,抗原-抗体反应受多种因素影响电解质：抗原-抗体反应通常应用0,凝集反应(Agglutination),细菌、红细胞等颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原（或抗体）中加入相应抗体（或抗原），在电解质存在的条件下形成凝集物的现象，称为凝集反应。,凝集反应(Agglutination),凝集反应的分类,直接凝集反应 间接凝集反应间接凝集抑制试验协同凝集试验抗球蛋白试验,凝集反应的分类直接凝集反应,直接凝集试验（Direct Agglutination）,细菌或红细胞等颗粒性抗原与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。 1. 玻片法：定性试验 菌种鉴定

13、及血型鉴定 2. 试管法：半定量试验 抗体效价滴定,直接凝集试验（Direct Agglutination）,间接（被动）凝集反应（Indirect/Passive Agglutination）,将可溶性抗原（或抗体）吸附于一种与免疫无关的、一定大小的载体表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在电解质存在的条件下出现凝集现象。,间接（被动）凝集反应（Indirect/Passive A,间接凝集抑制试验（Indirect Agglutination Inhibition）,可溶性抗原与相应抗体充分作用后，再加入抗原致敏的载体颗粒，此时因抗体已被可溶性抗原结合，不会再出现载体凝集现象。,间接凝集抑

14、制试验（Indirect Agglutinati,协同凝集试验（Coagglutination）,金黄色葡萄球菌细胞壁中的A蛋白（SPA）能与人及哺乳动物血清中IgG类抗体的Fc段结合。IgG的Fc段与SPA结合后，其Fab段与特异性抗原结合出现特异的凝集现象。 检测血液、脑脊液及其他分泌液中的微量抗原。,协同凝集试验（Coagglutination）,免疫实验课安排课件,抗球蛋白试验（Antiglobulin Test，Coombs Test）,某些血球凝集反应，如Rh红细胞与抗Rh抗体的反应，因抗体为IgG，结合价为两价，与IgM相比，分子较小，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞间的排斥力

15、，不出现红细胞凝集现象。若加入抗IgG的抗体，则可以在包被了Rh抗体的红细胞之间建立数量较多、距离较远、因而排斥力较小的联接，引起凝集现象。,抗球蛋白试验（Antiglobulin Test，Coom,免疫实验课安排课件,沉淀反应（Precipitation),血清、蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体在电解质存在的条件下结合出现沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。,沉淀反应（Precipitation),沉淀反应的分类,双向免疫扩散单向免疫扩散 对流免疫电泳 火箭电泳免疫电泳,沉淀反应的分类双向免疫扩散,双向免疫扩散

16、 （Double Immunodiffusion),在琼脂板上按一定距离打两个小孔，将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。 本法常用于抗原或抗体的定性 、组成的检测。,双向免疫扩散 （Double Immunodiffusio,在中间孔加入定量的抗体，按一定距离在四周打数个小孔，分别加入不同稀释度的抗原，可形成粗细不等的沉淀线，从而可判定抗体的效价。,双向免疫扩散(Double Immunodiffusion),在中间孔加入定量的抗体，按一定距离在四周打数,定性实验,检测两

17、种抗原的相关性,双向免疫扩散(Double Immunodiffusion),定性实验 检测两种抗原的相关性双向免疫扩散,单向免疫扩散(Single Immunodiffusion),将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比。 本法常用于测定血清IgG、IgM、IgA 和 C 3等的含量。,单向免疫扩散(Single Immunodiffusion,免疫实验课安排课件,对流免疫电泳(Counter Immunoelectrophoresis),在电场中进行的双向免疫扩散。

18、,对流免疫电泳(Counter Immunoelectrop,免疫实验课安排课件,电渗：电场中溶液相对于固体的移动。琼脂是酸性物质，在碱性溶液中带负电，而与它接触的溶液带正电，因此液体向阴极移动。,电渗：电场中溶液相对于固体的移动。琼脂是酸性物质，在碱性溶液,火箭电泳（Rocket Electrophoresis),火箭电泳也称电免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。 此法的特点是需时较短，故可用于快速测定标本中抗原的含量。,-,+,火箭电泳（Rocket Electrophoresis),免疫电泳(immunoelectrophoresis),免疫电泳(immunoelectrophoresis),