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1、免疫学检测技术及应用,免疫学检测技术应用： 1. 疾病的诊断、治疗效果评价及发病机理探讨： 如：感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应、肿瘤等 2. 免疫分子的定性、定量测定： 如：细胞因子、粘附分子、细胞受体、补体、抗体等,3. 抗原物质的定性、定量检测： 如：病原微生物及其代谢产物，组织细胞、蛋白质等 4. 免疫细胞的分离、鉴定及功能测定： 如：T细胞及其亚群等,抗原抗体反应抗原与相应抗体在体内或体外相遇可发生特异性结合，呈现的某种反应现象。,抗原抗体反应有以下几个特点: 1.抗原与抗体结合是特异性结合 表位(抗原)超变区(抗体) 2.抗原抗体结合是分子表面
2、的非共价键结合 氢键、疏水键、静电引力和范德华力(Van der waals force) 、电子云力的合力。 抗原和抗体可解离,性质不变。,3.抗原抗体反应可分为两个阶段 （1）特异性结合阶段 此阶段需时短,仅需几秒到几分钟,无可见 反应出现 （2）可见反应阶段 需时较长,数分,数小时或数日出现可见现 象,表现为沉淀,凝集,细胞溶解等 4.抗原和抗体结合是否呈现明显可见的反应现 象,与两者的分子比例密切相关,抗原抗体反应的主要影响因素： 1.电解质: 在中性或碱性条件下,抗原抗体均带负电荷,适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而互相结合,出现明显的沉淀或凝集现象。 2.温度: 37 3.
3、 酸碱度: pH6-8,抗原抗体反应包括： 沉淀反应 凝集反应 溶解反应 补体结合反应 中和反应 已知抗体 检测未知抗原； 已知抗原 检测未知抗体。,Sensitivity of varior immunoassays,一、沉淀反应(precipitation) 可溶性抗原与相应抗体在电解质存在条件下结合，出现沉淀物的现象。 沉淀反应的试验方法：环状法 絮状法 琼脂中沉淀法,琼脂中沉淀反应法： 双向免疫扩散(double immunodiffusion) 单向免疫扩散(single radial immunodiffusion) 对流免疫电泳(counter immunoelectrophor
4、esis) 火箭电泳(rocket electrophoresis) 免疫电泳(immunoelectrophoresis),二、凝集反应(agglutination) 颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原(或抗体)于相应抗体(或抗原)，在电解质存在下出现凝集物的现象。,凝集反应包括： 直接凝集反应 (direct agglutination) 间接(被动)凝集反应(indirect/passive agglutination) 间接凝集抑制试验(indirect agglutination inhibition test) 协同凝集试验(coagglutination test) 抗球蛋白试
5、验(antiglobulin test，Coombs test),三.免疫标记技术 用荧光素、同位素、酶及发光等示踪物质标记抗体(或抗原)，与抗原(或抗体)进行反应，通过检测示踪物质，分析被检抗原(或抗体)的存在或含量的方法。 灵敏度：高，1X10-4 1X10-5ug抗体/ml 应用：微量物质的定性、定量或定位。,免疫标记技术的基本类型：（一）免疫荧光技术(immunofluorescence technique) （二）免疫酶技术(immunoenzymatic technique) （三）同位素标记技术(isotope labelling technique)（四）发光免疫测定(lumi
6、nescent immuno-assay, LIA)（五）免疫胶体金标记技术(colloidal gold immunogold staining),（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧光抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检抗原的存在。 免疫荧光技术包括： 直接法 间接法 间接补体增强法,Direct and indirect immunofluore-scence staining of membrane antigen (mAg).,（二）免疫酶技术(immunoen
7、zymatic techniques) 是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用相结合的一种方法。主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）,1.免疫酶染色(又称免疫组化技术, immunohistochemistry technique) 原理：用酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等) 标记抗体(酶标抗体)，将酶标抗体与抗原(细胞或组织切片)作用，抗原与酶标记抗体结合，加底物，酶催化底物产生有色物质，观察结果。 应用：细胞内、组织内抗原的定性、定量和定位检测。,2.酶免疫测定 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbe
8、nt assay, ELISA) 原理：将抗原(或抗体)结合于固相载体；与抗体(或抗原)反应；加酶底物，酶促反应。 灵敏度：2X10-5 gml 应用：广泛，可检测微量抗体和抗原(如微生物成分、激素、细胞因子、粘附分子等）。,ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法,ELISA,(三) 同位素标记技术(isotope-labelling technique) 放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA) 是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pgmL 特异性强 应用：微量抗原和抗体检测。 缺点：不稳定，废物处理
9、麻烦等。,（四）发光免疫分析(luminescent immuno-assay, LIA) 原理：用发光物质标记抗体(或抗原),再同抗原(或抗体)进行反应，以发光现象作为抗原抗体反应的指示系统。 应用：定量检测抗原、抗体。 发光分为：化学发光(chemiluminescence) 生物发光（bioluminescence）,化学发光原理： 发光物质 激发态分子 基态分子 释放光子(发光) 化学发光剂：鲁米诺（luminol ） 反应剂：过氧化阴离子,反应剂,（五）免疫胶体金技术(colloidal goldimmunogold staining) 原理：胶体金标记蛋白质(如抗体) + 组织细胞
10、(待测) 观察结果(用电镜、光镜或肉眼) 应用：免疫组织化学定位，测定细胞表面标志和细胞内成分。 优点：易行、省时、价廉、灵敏度高。 胶体金：用还原法将四氯金酸(HAuCl4)制成特定大小的金颗粒，该颗粒由于静电作用呈稳定的胶体状态，称为胶体金。,淋巴细胞的检测技术一.淋巴细胞的分离 1.外周血单个核细胞(淋巴细胞 90%)的分离 密度梯度离心法,(密度为1.077),(2000rpm,15min),2.尼龙纤维分离法： 单个核细胞 通过尼龙纤维柱 B细胞和单核细胞(粘附特性) T细胞(非粘附性)。3.流式细胞术（flow cytometry, FCM）： 荧光素标记抗体待检细胞单列经过FAC
11、S分离（荧光素不同）的细胞 * FACS：荧光激活细胞分类仪(fluore- scent activated cell sorter),流式细胞仪,4.磁珠分离术： (1)直接法： 免疫磁珠(磁性微粒结合抗体) + 细胞 通过磁场 分离磁珠结合细胞 +解离剂 获纯化细胞 (2)间接法： 免疫磁珠(磁性微粒结合第二抗体) + 细胞 + 抗体 通过磁场 分离磁珠结合细胞 +解离剂 获纯化细胞,淋巴细胞的功能测定技术（一）体外法 1淋巴细胞增殖检测3H-胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR）: 间接观察DNA合成含量。灵敏度高，具有放射性。四甲基偶氮唑盐法（MTT）: MTT商品名为噻唑蓝。原理：活细胞
12、线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性MTT还原成蓝紫色结晶-甲瓒（formazan）, DMSO使其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性差。,二甲氧唑黄比色法（XTT）：XTT是一种MTT类似的四唑氮衍生物，活细胞将其还原成橘黄色甲瓒产物，水溶性，可直接酶标仪测定。加上电子耦合剂硫酸酚嗪甲酯（PMS）可提高其效率。快速、简便灵敏。XTT水溶液不稳定，现用现配，稳定性差。,四唑单钠盐法（WST-1）: WAT-1是一种类似于MTT的水溶性四唑盐，在PMS存在下被活细胞脱氢酶还原成橙黄色甲瓒产物，水溶性，直接酶标仪测定。WAT-1的水溶液比MTT 和XTT稳定。结果稳定，灵敏度高。可多次用酶标
13、仪重复检测结果。Cell-Counting Kit-8（CCK-8）: CCK-8中含有WST-8，较WST-1更新的四唑盐，检测原理与WST-1类似。操作更简便，检测结果更稳定、溶解性更高、灵敏度更高、保存时间更长。,（放射性核素摄取法）,2.细胞毒试验(1) NK细胞的细胞毒活性测定 放射性核素释放法 放射性核素标记靶细胞(K562细胞) + 效应细胞 培养 靶细胞破坏，释放放射性核素 测cpm值 NK细胞毒活性(%)= 100%,实验孔cpm值-自然释放孔cpm值,最大释放孔cpm值-自然释放孔cpm值, 乳酸脱氢酶(LDH)释放法 靶细胞(YAC-1细胞) + 效应细胞(小鼠脾胞)LD
14、H释放 + LDH底物(氧化型辅酶I、吩嗪二甲酯硫酸盐和硝基氯化四氮唑蓝) 形成甲基化合物(色) 测定OD570值 NK细胞毒活性(%)= 100%,实验孔OD值-自然释放孔OD值,最大释放孔OD值-自然释放孔OD值,Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC）,Generation of effector CTLs,MHC tetramers,Two pathways of target-cell apoptosis stimulated by CTLs,In vitro cell-mediated lympholysis (CML
15、) assay,3. 酶联免疫斑点法(ELISPOT) 抗原包被 B细胞 抗体产生并附着 第二抗体(酶标记) 底物 显色 抗体(抗细胞因子)包被 + T细胞 产生细胞因子并与抗体结合 + 第二抗体(酶标记) 底物 显色,（二）体内法 抗原定量注入皮内，4872小时后观察结果。 结果判定： 阳性：注射局部出现红肿、硬结，直径0.5cm 弱阳性：硬结直径0.5cm 阴性：无变化 实际意义： 阳性 细胞免疫功能正常者 弱阳性或阴性 多为细胞免疫功能低下者 * 常用的抗原为结核菌素(OT) 、PHA,皮内注射法,划痕法,细胞因子的检测技术一、 生物学检测技术 依赖细胞株测定法 二、 免疫学检测技术 E
16、LISA法三、分子生物学检测技术 分子杂交、PCR 等检测mRNA,细胞因子检测的特点 样品含量低样品具有时效性生物效应特异性差,Figure 14-12,细胞因子的功能 Cell activation Cell growth and differentiation Induction of MHC Induction of cytokine receptors Promotion of antibody class- switching,影响细胞因子作用特异性的因素 Only antigen-activated lymphocytes express receptors Different
17、combinations of receptor subunits result in low-, intermediate-, or high-affinity receptors Requirement of cell-cell interaction Short half-life of cytokines Cytokine antagonists Synergistic and antagonistic interactions among cytokines,限制细胞因子临床应用的因素High local concentrations of cytokines during immu
18、ne response cannot be mimicked clinically Short half-life of cytokines Pleiotropic effects can cause unpredictable side-effects,细胞因子的生物学检测检测方法与原理 细胞增殖或增殖抑制试验 细胞病变抑制试验 细胞毒试验 细胞趋化试验,检测中的操作注意要点 靶细胞的选择与培养 检测标本的制备 显示检测结果,2022/11/8,靶细胞的选择与培养 1、对所测的细胞因子有特异的敏感性 2、易培养、保存、生物学特性稳定 3、有良好的生长状态 4、种属适配,2022/11/8,各
19、类细胞因子检测的常用靶细胞 细胞因子 实验系统 干扰因素 IL-1 D10（M）增殖法 IL-2、IL-4 EL-4（M）增殖法 IL-4 A352（H）增殖抑制法 IL-2 CTLL（M）增殖法 IL-4 IL-3 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法 GN-CSF、IL-5 IL-6、EPO IL-4 CTLL（M）增殖法 IL-2 IL-5 BCL-1（M）增殖法 IL-4,各类细胞因子检测的常用靶细胞 细胞因子 实验系统 干扰因素 IL-6 B9（M）增殖法 IL-4、IL-11 BM60（H）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b（M）增殖法 IL-8 中性粒细胞（M、H）
20、趋化法 GM-CSF TF-1（H）增殖法 IL-3、IL-5 IL-6、IL-5 TNF/ L929 （M、H）细胞毒法 IFN wish（H）病变保护法 IFN- IFN- L929（M）病变保护法 IFN- IFN-,检测标本的准备 1、分离特定的产生细胞 2、对产生细胞进行诱导、激活 3、选择适当的收集时间,2022/11/8,显示检测结果 1、细胞增殖状态的显示： 放射性核素掺入法、 胞内酶活性显示法 活细胞染色法 细胞荧光测定法 2、细胞毒或细胞病变状态的显示 活细胞染色法 胞内酶活性显示法 DNA断片测定法,2022/11/8,依赖细胞株测定法PBMC + PHA 培养 取上清液
21、 + CTLL-2细胞 培养 + MTT 培养 测OD570值,TNF对靶细胞的细胞毒活性 TNF对小鼠L929成纤维细胞株具有细胞毒活性，细胞死亡率与TNF生物学活性成正相关关系。 结晶紫染色死细胞 MTT检测活细胞 如同时加用转录抑制剂放线菌素D，可提高靶细胞对TNF的敏感性10-100倍。,滤膜：计数受趋化细胞,趋化因子,细胞,趋化试验原理示意,细胞因子的免疫学检测 分泌型细胞因子的检测 ELISA ELISPOT RT-PCR（分子生物学） 细胞内细胞因子的检测 免疫组化技术,细胞因子受体的存在 形式 膜型细胞因子受体 分泌型细胞因子受体,2022/11/8,细胞因子受体的检测方法 膜
22、型细胞因子受体的检测： 配体检测法 抗体检测法 分泌型细胞因子受体的检测： 标记抗体检测法,2022/11/8,细胞因子检测临床意义细胞因子 正常对照 病人 疾病 年代及受体 （pg/ml） （pg/ml） IL-1 0.160.17 0.530.57 肾细胞癌 2003 0.3 18.8 心绞痛 1996 166.7 38.528.8 胰腺炎 1994 IL-2 2.40.8 10.81.8 急性缺血性综合征 1999 IL-4 3.340.84 4.051.02 支气管高反应性 2003 IL-6 54.1 485.2 疟疾 2004 1.792.03 8.9113.12 肾细胞癌 200
23、2 42 1620 败血症 2001 2.10.1 101.6 风湿 2000 2.55 4.29 非酒精性脂肪肝 2003 1.10.1 18.62.1 原发性甲状旁腺功 1996 能亢进症 4.340.9 97.30.97 宫外孕 1996 12.30.8 9412.1 类风湿关节炎 1999 0.39 16 关节炎 2004 1.20.6 10.81.8 急性缺血性综合征 1999IL-6受体 25.11(ng/ml) 41.71.2(ng/ml) 原发性甲状旁腺功能 1996（可溶性） 亢进症,续表细胞因子 正常对照 病人 疾病 年代及受体 （pg/ml） （pg/ml）IL -8 6
24、3 331 败血症 2001 3.8 43.68 非酒精性脂肪肝 2003 16.3 1078181.5 泌尿道感染 1993 1 17.6 肝癌 2003 4.80.5 27.52.6 轻度子宫内膜异位症 2003 530.265.1 重度子宫内膜异位症IL-10 14.1 1099.3 严重疟疾 2004 9.21.5 17.74.4 非小细胞肺癌 2002 214.2 转移癌IL-13 35.2012.70 92.699.87 系统性红斑狼疮 2005IL-15 16.24 356 腹膜炎 2000IL-16 16323 28746 轻度子痫 2008 （正常妊娠） 51558 严重子痫
25、IL-18 2811 5121 充血性心力衰竭 2000IL-21 46690(ng/ml) 1051335(ng/ml) 原发性干燥综合征 2007,2022/11/8,细胞内细胞因子的测定技术（ICS） 激活细胞：多克隆激活剂，如佛波酯（PMA）和离子霉素（ionomycin）等或特定的抗原； 抑制细胞因子释放：阻断胞内高尔基体介导的蛋白质转运，用布雷菲德菌素A（Brefeldin, BFA）与莫能霉素（Monensin）等药物； 增加细胞膜通透性：多聚甲醛固定和皂角苷破膜； 荧光标记的抗细胞因子的特异抗体与细胞内细胞因子结合，通过流式细胞术（flow cytometry,FCM）进行检测
26、。,Principle of Plate-Based ICS Assays,Antigenic stimulus + brefeldin A,Incubate 6-24 h,Fix cells Permeabilize Stain,20 ml PBMC/WB sample,Gate on cellsof interest,ICS 应用,Measure production of cytokines in short-term stimulated whole blood, PBMC, etc.Can measure multiple cell-surface and intracellular
27、 markers in combination, using multiparameter flow cytometryCan detect rare events such as antigen-specific T cells,Example of ICS Results,pp65 protein,peptide mix,A2 peptide,CMV lysate,CD8,CD4,anti-IFNg FITC,CD69 PE,CFSE Assays,Cells (usually PBMC) are labeled with CFSE dye, then allowed to prolife
28、rate in vitro (or in vivo in mice)CFSE is divided equally among daughter cells, so each generation becomes half as intense in CFSE staining,免疫分子生物学技术1.免疫印迹试验(immunoblotting, Western blotting)(1)电泳：抗原(如蛋白质)在SDS-聚丙烯酰胺凝胶内电泳，各组分按分子量大小分开。(2)转印：将电泳后的蛋白质转移至硝基纤维膜上。(3)鉴定：用酶标记或同位素标记的抗体确定抗原的位置，并可得知其分子量的范围。,2.免疫PCR (immuno-polymerase chain reaction)原理： 抗原包被 + 抗体 + 亲和素-SPA融合蛋白 + 生物素-DNA片段 PCR扩增 测定扩增产物应用： 同一样品中多种抗原的分析与鉴定。,Thanks !,
