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1、军团菌及其检测技术,武汉市疾病预防控制中心微生物检验科赵滢 博士Email：2014年11月,军团菌的发现,1976年7月在美国费城，参加退伍军人大会的人员中爆发了一种症状相同，原因不明的细菌性肺炎， 有221人感染疾病，其中死亡34人。初步的流行病学分析显示，致病的微生物可能通过空气传播，采集标本，分离病原体革兰氏阴性杆菌嗜肺军团菌（L. pneumophila ）军团菌病 (已知的首次爆发),Part I：军团菌及军团菌病,军团菌,革兰阴性杆菌,浅红色的短杆菌，直径0.30.5m，长约1.25m或更长，菌体一端有鞭毛.在含L-半胱氨酸和焦磷酸铁的BCYE琼脂培养基上生长，通常需要在37 5
2、%CO2培养箱培养2-10天。生长形成的菌落一般呈白色，也可能会从紫色变为蓝色，或是灰绿色。,初步在BCYE琼脂培养基上生长的菌落为刻花玻璃样，具有多型性.,军团菌科、属、种、血清型,军团菌科 (Legionellaceae ）Legionella / Fluoribacter bozemanii / Tatlockia micdadei 军团菌属：16s rRNA分析表明，在蛋白细菌系亚群中，军团菌科只有一个军团菌亚群。与引起Q热病的coxiella burneti(贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的细胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞。军团菌种：现已发现50个种（speci
3、es），70多个血清型（serogroups)，至少有20个种可引起人感染。,军团菌种,军团菌病,Part II：样本的采集与运输,哪些环境中存在军团菌？,标本的种类,环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋浴水, 加湿器水； 病人组织标本:如痰,支气管灌洗液,胸水,血液等标本。,环境标本采集原则,最初流出的水标本：打开水龙头或装置后立即采集水样，该水样即代表设备内的水。过后流出的水标本：最初流出的水标本收集以后，让设备内的水流掉后再采集水样。此水代表供给设备的水。,环境标本采集,有杀生物剂时的采样：水样中含有氯或其它氧化性杀生物剂时，向采样瓶中添加适量硫代硫酸钾使其灭活。对于其它的生物剂
4、，加入普通的中性试剂是无效的。注意：样本采集到浓缩，以及样本采集到浓缩培养的间隔时间控制在14天以内。样本的来源，数量，有无杀虫剂都要登记，并同标本一起送到实验室。不知来源或不知道处理过程的水标本是不予进行试验的。,常见几种系统采集部位,冷水系统的采集：进水系统蓄水池与每个蓄水池相连的下水道的排出口蓄水池最远的下水道的排出口 对每一个装置来说，收集500ML最初流出的水标本，让水持续流，并在流水中放一只温度计，待温度稳定后，收集500ML过后流出的水标本。,热水系统加热器的排出口：选用保护性的橡胶手套和其它的保护性装备关掉离加热器最近的冷水系统。避免冷热水混合加热器的排水口可用火焰或酒精棉球消
5、毒干燥排水口连接一根干净的硅胶管 采样方式：打开开关采集最初流出的水标本。让水排掉至温度稳定为止。再采一份过后流出的标本，并关闭开关,淋浴器,收集最初流出的水标本如果淋浴器有一个大的莲蓬头式喷嘴，用一个干净的未用过的塑料袋，该装置包裹起来，切掉一个角，将该切口处置于接取标本容器的开口处,冷却塔,警告：为安全起见，采样前，负责供水系统的工作人员应关掉冷却塔的鼓风机。戴一副齐肘的橡胶手套，从池内舀水，由于机器继续运行而不能关闭冷却塔时，则需要采样人员做出专门的安排，这种情况下，应佩戴安全护目镜和呼吸道防护装备。在塔的入口处采样：将干净的硅胶管插入瓶内，通过虹吸作用吸取顶部蓄水池的水。先用水充满管子
6、并夹住其一端，以防止管子空了。管的一端放在蓄水池里，另一端放在采样瓶里，使瓶内管的一端低于蓄水池管的一端。松开夹子，水开始流出，取够所需的量，停止虹吸，将管从蓄水池内取出。,进水口远处采集池塘内的水：用勺子采取冷却塔，池塘表浅部位的粘泥（深度20cm)，用虹吸管采取池子深处的粘泥。采集位于该系统内滤器的水，沉淀物，碎砾等。注意：所需样品的数量取决于该系统内的大小和地理位置。如果蓄水池和水塔之间的管道短，那么只需采集一份标本。,标本的运输和相关生物安全要求,在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻,但要防止受热和阳光,标本要尽可能快或最好在两天内送到实验室,室温下(21+3)贮藏在实验室或其他地方
7、。对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，应放在-20冻存备用。,军团菌操作生物安全性,应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。生物安全级实验室，最好在安全柜中操作。操作人员培训。菌种保存。,可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定,Part III：军团菌的分离与检测,水样标本中军团菌的分离方法,检测依据: 公共场所集中空调通风系统卫生规范中的集中空调通风系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌的检验方法见附录B。 适用于各种环境标本军团菌检测 ，包括： 饮用水、工业用水、天然水以及一些如沉积物、沉淀物、软泥等物质。,标本,肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流
8、物,水样,血清,水样处理与制备,血清学检测方法：*间接荧光抗体染色法*试管凝集试验*ELISA法,接种军团菌BCYE培养基,接种军团菌选择性GVPC培养基,37，5%CO2，培养3-14天,挑可疑菌落革兰氏染色涂片镜检,37,5%CO2,培养3-14天,革兰氏染色阴性杆菌,革兰氏染色阳性杆菌,纯培养,弃去,确认试验,血清玻片凝集试验,PCR检测,生化试验,尿液,抗原检测,军团菌水质检测概括,采样浓缩培养分离鉴定,实验所需仪器设备,90mm平皿3537孵箱滤器（大的不锈钢制成的滤器）正压膜蠕动过滤泵：流速可调。3升/分钟注意：样本量少，也可用真空辅助的滤过系统代替膜滤器：0.22um或0.45u
9、m水浴锅：离心机：涡旋振荡器：显微镜：,军团菌检测所需准备基本试剂,培养基（GVPC，BCYE,BCYE-CYS)试剂 (生化试剂、甲醛的盐溶液）酸缓冲液（0.2mol/L KCL-HCL)，碱缓冲液（0.03mol/L KOH）血清学试剂,培养检测所需准备材料,直径大约为90mm或100mm的无菌培养皿培养箱，CO2能够恒温保持在（361）。水浴箱，能够保持在（501）显微镜或荧光显微镜。,样品采样准备材料,玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理。水样一般采集为250-500ml，收集在容器瓶中。如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高压，可用流动的热水（不低于70）或蒸汽进行巴斯德氏消毒，时间不低
10、于5分钟。小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物。广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖。灭菌棉拭子。一般建议用塑料包装的容器,军团菌培养基,Muller-Hinton琼脂,第一次分离出嗜肺军团菌使用的培养基,活性炭酵母抽提物琼脂，活性炭替代培了淀粉以去除培养基的毒性，并且氨基酸也逐渐被酵母抽提物替代,CYE琼脂,CYE琼脂加入-酮戊二酸,BCYE琼脂,BCYE琼脂中含有选择性抗生素,GVPC琼脂,军团菌培养基,军团菌分离培养用BCYE培养基,酵母浸出物10.0g 活性炭2.0g琼脂17.0g酮戊二酸1.0g蒸馏水950 mL半胱氨酸盐酸盐0.4g可溶的焦磷酸铁0.25g,半胱氨酸和焦
11、磷酸铁分别溶于10 mL蒸馏水，分别过滤（0.45m滤器）。将剩余培养基成分溶于950 mL蒸馏水，高压灭菌。水浴冷却至50，加入上述过滤液。10 N KOH调整pH至6.9。蒸馏水补充至1L。倒培养基前先摇动混匀以保持碳呈悬浮状态。每平板20ml （15100mm），斜面10ml或4ml（20150mm或13100mm）。,ACES缓冲液(2乙酰基2氨基乙烷磺酸) 10.0g,选择性（GVPC）培养基的制备,添加四种抗生素：甘氨酸3g/L（稳定剂，防腐剂，缓冲剂）多粘菌素B（硫酸盐）79200iu/L（抑制大肠肺克，百日咳等）万古霉素（盐酸盐） 0.001g/L（金葡，化脓性链球菌，白喉，肺
12、链，炭疽等）放线菌酮0.08g/L（杀真菌，致畸，）那他霉素也可代替之。,抗生素的配制,多粘菌素B：200mg加入100蒸馏水中，混匀后，.uM滤器过滤除菌，以5.5量分装到无菌瓶内，冷冻保存。用时在室温下孵化。万古霉素：20mg加入20蒸馏水中，混匀后.uM滤器过滤除菌，以ML量分装到无菌瓶内，冷冻保存。用时在室温下孵化。放线菌酮：2g加入100蒸馏水中，混匀后，.uM滤器过滤除菌，以4 ML量分装到无菌瓶内，冷冻保存。用时在室温下孵化。注意：放线菌酮具有肝毒性，当处理这种粉末状试剂时，应该带手套和防尘口罩。,GVPC培养基的制备,按上述BCYE培养基的方法配制完成后，冷却至50 C时，分别
13、添加已配制好的三种抗生素。每种取一份剂量，充分混匀后即为最终选择性培养基。,BCYE-Cys培养基,为不含L-半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培养基。按照配制BCYE培养基的方法配制，不加L-半胱氨酸。,半成品培养基,培养基的质控,注意：消毒过程中，加热时间过长或温度过高，都能影响培养基的营养质量。培养基成分每批间的差别（特别是酮戊二酸）也能影响其效能。所以，检验各批次新配制的培养基是十分必要的。孵育三天，观察其支持军团菌的能力来判断。选择新鲜培养的LP1型参考菌株和分离到的LP1菌株（勿超过10代）制成菌悬液，分别接种到新旧两个批次的培养基上。孵育之后记录和比较结果，确保其菌落形态和菌落数量是相同
14、的。,水样的正压膜过滤法,安放滤膜；过滤；取膜；洗膜。,水样浓缩物的贮存,最好对样品立刻进行分析；标本于（62）储藏最多不超过15天。 对于军团菌来说，如果储藏于06，这种损失是最明显的。而且，温度在20或20以上时，异养生物的生长速度就会变快。,两种处理方法,热处理：将浓缩好的样品混匀后分别取1ml 于无菌管中，放到50度水浴内保温30分钟；酸处理: 取适量浓缩好的样品混匀后离心，6000rpm10分钟。灭菌管吸去上清，至原来一半的量。再次重悬混匀，加入酸缓冲液至原来的量，并轻轻混匀，室温下静置5分钟，备用。,选择培养基的接种,将100ul浓缩好的但未经任何处理的标本接种到GVPC平板上，用
15、无菌接种环将液体均匀涂布在整个培养基表面。用同样的方法，从水浴中取出热处理的标本，吸取100ul接种到GVPC平板上。同样，经酸处理的立即接种。,接种标本培养,接种过的培养基静置直至接种物被完全吸收，然后将平板倒置，在（361）培养7-10天。为了保证培养箱内的空气的湿度，可以在培养箱内放置一个盛水的碟子。在每次观察培养物时，向碟子内注满新鲜的水（根据需要）。在含2.5-5.0% CO2的环境下培养有利于军团菌的生长。,平板的检查,培养时间内，48小时后，每天观察菌落生长情况。军团菌菌落通常呈灰白，灰绿，紫色和蓝色。表面光滑，边缘整齐。一种的菌落（博杰曼军团菌，高曼，杜莫夫等）能自动发出白色耀
16、眼的荧光。,孵育不同时间菌落生长情况,军团菌菌落特点（1）,军团军菌落通常呈灰白色，但也能呈蓝色、灰绿色、深褐色或深红色。一般表面光滑湿润，边缘完整，并显示典型的毛玻璃样外观。在紫外灯下，某些种的菌落（博杰曼军团菌、高曼军团菌、杜莫夫军团菌、安绥军团菌、奇锐军团菌、斯泰戈瓦尔特军团菌、格瑞梯纳军团菌、图森军团菌、巴黎军团菌）能自动发出白色的耀眼荧光；某些种的军团菌也能发出红光。,军团菌菌落特点（2）,嗜肺军团菌的菌落呈暗淡的绿色，并常伴有浅黄色。为了避免军团菌被杀死，平板暴露于紫外灯下不能超过规定时间。值得注意的是，新发现的某些种的军团菌所具有的特征可能会和上述特征有所区别。,可疑军团菌菌落的
17、进一步鉴定,BCYE或其他培养基上传代培养革兰染色镜检生化鉴定PCR检测军团菌特异性基因片段免疫荧光的方法确定军团菌的种类,BCYE或其他培养基上传代培养（1）,至少从每块GVPC平板上挑选出两个典型的军团菌菌落，在BCYE和BCYE-Cys培养基上传代培养，传代培养要在两种培养基上同时进行。在（361）至少培养两天。凡是在BCYE培养基上生长而在BCYE-Cys培养基上不生长的菌落即可初步认定为军团菌。,BCYE或其他培养基上传代培养（2）,营养琼脂或血琼脂培养基可以代替BCYE-Cys培养基。如果在这三种培养基上都不生长，原来选择性培养基上的可疑军团菌菌落应该继续传代培养。橡树岭军团菌和幽
18、灵湖军团菌在初次分离培养时需要L-半胱氨酸和铁离子，但随后在L-半胱氨酸缺失时生长微弱。,BCYE培养基上传代培养,BCYE,血平板,BCYE不含半胱氨酸,革兰染色镜检,军团菌是革兰染色阴性，浅红色的短杆菌，直径0.30.5m，长约1.25m或更长，菌体一端有鞭毛，长时间培养后鞭毛可能变成长丝状。,短杆状,长丝状,军团菌生化鉴定,确定军团菌的种型,Oxoid 的乳胶试剂盒可以鉴定出： 嗜肺军团菌血清1型; 嗜肺军团菌血清2-14混合型； L. longbeachae1和2型 ，L. bozemanii1和2型，L. dumoffii，L. gormanii，L. jordanis，L. mic
19、dadei， L. anisa混合型。,确定军团菌的种型-1,在进行鉴定试验前，要保证在BCYE培养基上生长的菌落是经过形态学检查的纯菌。属的鉴定，16sRNA。,嗜肺军团菌的确定,应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。有条件的可做嗜肺军团菌特异的PCR检测。生化培养：氧化酶（/弱+），硝酸盐还原，尿素酶，明胶液化，水解马尿酸,淀粉酶水解弱+血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。PCR：mip,dnaJ,军团菌血清鉴定,日本生研所Lp1-6,Lb,Lg,Lm,Ll,结果表述,为了计算原始水样或沉积物中菌落形成数（CFU/ml），从三块GVPC平板培养基中挑选出已确定军团菌生长最多的平板
20、。根据浓缩倍数推算出原始水样中的细菌数。计算三个GVPC平板培养基上菌落生长的平均数是不适宜的，因为这是不能累加的。,检验报告,实验报告应包括以下信息国际标准的参考鉴定该标本的全部必需的细节，包括采样部位、采样时的操作、样品性质、水系统或植物的种类、采样点的类别。被检测标本的体积和数量采样日期样品收集日期实验室接收日期实验室检测日期分析过程中所观察到的任何情况都可能影响最后的结果。,菌株保存,短期保存 将军团菌接种在BCYE斜面培养基上，可以在4保存数周。长期保存 如要长期保存军团菌，最好用冻干保存法或低温冷冻保存法。而冻干保存法因为在4 或 20 存时间更长，且运输过程中不受影响，因此是最好的保存方法。,低温冷冻保存法,1、将军团菌接种在BCYE平板上， 361，2.5%-5% CO2培养箱或烛缸中培养，确定没有污染。2、将已灭菌的含有ACES、L-半胱氨酸和15%-20%甘油的保存液分装至2ml的螺帽冻存管中，每管1ml。3、用灭菌棉签从BCYE平板上刮取适量细菌。放入以上装有保存液的冻存管中。注意，使用的冻存管必须能耐受低温。4、将冻存管放入-70 冰箱保存。也可以放于-20冰箱，但是菌株存活率可能受影响。,谢 谢 ！,
