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1、双向琼脂扩散试验,授课对象：临床医学专业八年制本科授课教员：汤玉瑜 授课单位：第三军医大学基础部免疫学教研室,教学重点 琼脂的制备方法 双向琼脂扩散实验的原理,实验目的 掌握双向琼脂扩散试验的原理 理解琼脂的制备方法 了解双向琼脂扩散实验的应用,教学难点 如何根据沉淀线判断抗原或抗体的浓度,使用教材免疫学实验第一版 朱道银 吴玉章 科学出版社 2008,参 考 书免疫学第四版 龚非力 科学出版社 2007 Medical Immunology10th，T.G.Parslow,推荐网站医学免疫学网络教学 http:/192.168.10.21/mta/美国国立生物技术信息中心：http:/www
2、.ncbi.nlm.nih.gov中国生物信息网：http:/www.biosino.org,概 述临床免疫检验技术的出现最早可追溯至19世纪末。1896年，Widal发现在伤寒杆菌中加入伤寒病菌人的血清可致伤寒杆菌发生特异的凝集现象，利用这种凝集现象可有效的诊断伤寒病，这就是最早用于病原体感染诊断的免疫凝集试验，亦即著名的肥达试验(Widal test)。,常见的免疫检验技术：经典的免疫学反应凝集反应沉淀反应补体结合反应中和反应免疫电泳技术免疫标记技术免疫荧光免疫酶技术放射免疫测定,抗原抗体反应（antigen-antibody reaction）是抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
3、它既可发生在体内，也可发生在体外。 体外的抗原抗体反应表现为沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合、中和反应等反应现象。,兰德施泰纳，1868年-1943年，普林斯顿洛克菲勒医学研究所，发现人的主要血型系统而获1930年诺贝尔生理学或医学奖 。他最初研究化学,1896年後对血清学和免疫学产生兴趣,将化学方法引入血清学研究,发现不同人的血清与血细胞混合後可发生凝集反应,1901年用抗A血清和抗B血清将血液分成ABC(後称O)三型。,沉淀反应（precipitation）是可溶性抗原与相应抗体在电解质存在的条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。 影响沉淀反应的主要因素 1.抗原、抗体反应的浓度、比例 2.
4、电解质 3.温度 4.酸碱度,分 类,沉淀反应,环状沉淀反应,絮状沉淀反应,琼脂扩散试验,双向扩散,单向扩散,电泳技术,火箭免疫电泳,对流免疫电泳,Question:,怎样才能在无特殊仪器设备而又操作简便的定性检测血清中各种免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙肝表面抗原等？,实验原理,可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂糖凝胶板的对应孔中各自向四周自由扩散,若两者分子比例适当,则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线.,沉淀物形成的主要原是因为抗原与抗体分子表面的疏水基团相互接近而有效的排出它们之间的水分. 免疫复合物的形成通常经过两步:抗原与抗体的特异性结合;形成肉眼可见的免疫复合物晶格,
5、1.检测未知抗原或抗体2.抗原性质分析 3.抗体效价滴定4.抗原或抗体纯度鉴定,双向琼脂扩散试验的应用,Ag,Ab,A B C D E F,A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似；,B：浓度Ag、Ab近似，扩散率AgAb ；,C：浓度Ag、Ab近似，扩散率AgAb ；,D：浓度AgAb，扩散率近似；,E：浓度AgAb，扩散率AgAb ；,F：浓度AgAb，扩散率AgAb ；,检测未知抗原或抗体,1:待检Ag 2:标准Ag,待检Ag与标准抗原完全吻合,待检Ag中含有与标准Ag相同的Ag；还有另外的Ag与Ab相对应,待检Ag有与Ab相对应的Ag,但与标准Ag不同,待检Ag与标准Ag性质相同；但含量较低,
6、抗原性质分析,1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。,2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为 该抗体的效价。,3.可进行任意稀释。,抗体效价滴定,“1” 为单一抗原抗体系统。,“n” 为多个抗原抗体系统。,*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。,抗原抗体纯度鉴定,*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。,单向免疫扩散,将一定量的抗体混入琼脂糖凝胶中，使待测抗原在凝胶中自由扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。是一种定量试验，一般是用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、I
7、gA 及IgM的水平。,1.测定沉淀环直径2.在标准曲线上查找相应抗原浓度,绘制标准曲线,标准品抗原浓度测定,不同病人抗原浓度测定,影响因素,1.抗原分子量：与扩散速度、沉淀环反相关,6.琼脂板厚度：与沉淀环反相关,2.抗体种类：兔抗血清优于马、羊,3.抗体稀释度：抗体浓度大沉淀环小,4.扩散时间：抗原含量高，扩散时间长,5.扩散温度：437内温度与扩散速度正相关,实验材料,1人血清.2. 兔抗人 IgG 。3琼脂糖凝胶板，1%生理盐水。4其他：加样器、3mm打孔器、模板、湿盒、恒温箱等。,实验方法,1琼脂板的制备 将载玻片置于水平台上，吸管吸取加热融化的1%琼脂糖均匀浇在载玻片上，注意勿产生
8、气泡。2. 打孔：待琼脂糖凝固后，将琼脂板至于图样上，用3mm打孔器打孔，孔间距为5mm(按模板进行)，孔的排列方式如图所示。,3加样：于中央孔加入兔抗人 IgG，周围 1-4 孔加入倍比稀释不同浓度的人血清， 5孔加入生理盐水作对照。每孔各加15l。4将琼脂板平放于湿盒内，置37温箱中，分别于24小时观察结果。,实验结果判定,观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1 至4 孔（1:5、1:10、1:20、1:40 的人抗兔IgG）与中央孔(人血清)之间是否可出现清晰的乳白色沉淀线。沉淀线与中央孔的距离随抗原的浓度减小而增大。5孔是生理盐水，为阴性对照，与中间空间无白色沉淀线。免疫血清的滴度以一定
9、抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。,结果分析 沉淀线与中央孔的距离随抗原的浓度减小而增大。,结果分析,抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。 抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。,注意事项,加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形成。 反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导 致假阴性、不出现或不清楚。 加样时不同浓度抗体和抗原不要混淆，影响试验结果。 试验前应做预试验，确定抗体的稀释度。,思考题,试述双向琼脂扩散实验的基本原理？双向琼脂扩散有哪些实际用途？试用双向琼脂扩散设计一个抗原性质分析的实验。,
