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1、基因工程的基本步骤,基因操作的基本步骤,基因工程的基本过程,基因操作的基本步骤,1）获得目的基因（目的基因的获取 ）2）制备重组DNA分子（基因表达载体的构建 ） 3）转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）4）筛选重组细胞5）实现功能表达,目的基因的检测和表达,目前被较广泛提取使用的目的基因有： 苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。,将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。,(一）获得目的基因,目的基因的提取方法,直接分离基因人工合成基因,反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA,：鸟枪法,1）鸟枪法：,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限
2、制酶,与载体连接载入,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,(散弹射击法、直接分离法),用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的
3、mRNA,单链DNA(cDNA),双链DNA(即目的基因),反转录,合成,2）反转录法：,3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,
4、哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？,1）DNA序列自动测序仪：2）PCR技术：,对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大,染色体,PCR 基因放大连琐反应,聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR),2）聚合酶链式反应即PCR技术,（二）基因表达载体的构建,基因表达载体的组成：,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,e、复制原点,启动子：位于基因的首端的一段特殊的D
5、NA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质,结构基 因,RNA聚合酶,半乳糖苷酶,酶,酶,启动子,RNA聚合酶,终止子：位于基因的尾端的一段特殊 的DNA片断，能终止mRNA的 转录,标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,目的基因,限制性内切酶,T4 DNA连接酶15C,重组体,目的基因 自连,基因组,（三）目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,转化 ,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,方法,将目的
6、基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍（2）原理及适用范围,2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（2）程序：,2.微生物作受体细胞原因：,将目的基因导入微生物细胞,3.转化方法：,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,处理细胞细胞表达载体与感受态细胞混合 _细胞吸收DNA分子。,Ca2+,感受态,感受态,1.常用菌：,（四）目的基因的检测和表达,初选,再次检测,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因
7、,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交,抗原抗体杂交,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃
8、后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,从苏云金芽苞杆菌中提取抗虫基因,从土壤农杆菌中提取带有选择性标记的质粒,同一种限制酶处理,抗虫基因与质粒结合形成重组质粒,将重组质粒导入土壤农杆菌,筛选,将土壤农杆菌与棉花细胞混合培养,侵染,重组质粒将抗虫基因导入棉花细胞并整合到棉花的DNA上,植物组织培养,获得抗虫棉,抗虫棉的培育流程图：农杆菌转化法,重组DNA技术操作的主要步骤,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组DNA,cDNA,人工合成,PCR产物,限制酶消化,开环载体DNA,目的基因,DNA连接酶,重组体,转化,体外包装,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,DNA分子杂交鉴
9、定,个体水平,抗原抗体反应,1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练习,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,练习,
