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1、10.11.2022,1,2 显微镜和显微技术,10.11.2022,2,10.11.2022,3,借助于显微镜观察微生物的方法即显微技术，显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。,10.11.2022,4,显微镜的种类和原理,显微观察样品的制备,10.11.2022,5,一、显微镜的种类和原理,(一)、光学显微镜,普通光学显微镜,暗视野显微镜,相差显微镜,荧光显微镜,现在的光学显微镜分辨的最小极限达0.2m。,10.11.2022,6,普通光学显微镜的几个基本概念,10.11.2022,7,10.11.2022,8,10.11.2022,9,10.11.2022,10,10.11.202
2、2,11,1、普通光学显微镜,由三部分构成照明系统：包括光源和聚光器；光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；机械装置：用于固定材料和观察方便,10.11.2022,12,油镜使用,光镜使用方法,10.11.2022,13,2、暗视野显微镜,原理：聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。适用范围：生活细菌运动性观察。,10.11.2022,14,特点:只能看到物体的存在与运动,不能辨清其微细结构。,暗视野显微镜的使用,10.11.2022,15,基本原理:把透过标本的可见
3、光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。,3、相差显微镜,相差显微镜使用,10.11.2022,16,微分干涉差显微镜DIC显微镜下的硅藻形态,适用范围：对透明的活体进行直接观察,10.11.2022,17,4、荧光显微镜,原理：荧光素吸收紫外线并放出部分波长较长的可见光，发荧光的物体会在黑暗背景显现为光亮有色物体,10.11.2022,18,绿色：铜绿假单胞菌 黄色：蜡样芽孢杆菌,绿色：微管红色：微丝蓝色：核,10.11.2022,19,1931年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装配完成的。用高速电子束代替光束。放大倍数可达80万倍，分辨的最小极限达0.2
4、纳米。,（二）电子显微镜,透射电子显微镜,扫描电子显微镜,10.11.2022,20,1、透射电子显微镜,目前TEM的分辨力可达0.2nm。用电子束作光源，用电磁场作透镜。用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。放大倍数最高可达近百万倍.由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。,10.11.2022,21,高尔基体的TEM照片(伪彩色),10.11.2022,22,10.11.2022,23,2、扫描电子显微镜,扫描电子显微镜,大肠杆菌扫描电镜图,工作原理：电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，
5、经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。 主要用于：样品表面结构,10.11.2022,24,扫描电子显微镜原理,10.11.2022,25,10.11.2022,26,3、扫描隧道显微镜（STM）,扫描隧道显微镜拍摄的7个铀原子团,10.11.2022,27,10.11.2022,28,4 原子力显微镜,10.11.2022,29,10.11.2022,30,光学显微镜和电子显微镜的特点比较,10.11.2022,31,（一）光学显微镜制样,活体观察,染色,压滴法,悬滴法,菌丝埋片法,活菌,死菌,美蓝染色,简单染色,鉴别染色,革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色,二、显微观察样品的制备,
6、10.11.2022,32,（1）压滴法：菌悬液滴于载玻片上，加盖玻片，观察。（2）悬滴法：盖玻片中央加一小滴菌悬液，翻转置于特制的凹载玻片上，观察。（3）菌丝埋片法：无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，培养，取下玻璃纸置于载玻片上，观察菌丝形态。,光学显微镜样品制备活体观察,特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察,10.11.2022,33,用途：微生物的细致形态和结构 染色前需要对样品固定. 常用固定方法：酒精火焰加热、化学固定,光学显微样品制备染色观察,10.11.2022,34,1)、简单染色法：涂片干燥固定染色水洗干燥镜检
7、2）、革兰氏染色法：涂片固定结晶紫色染色水洗碘液媒染水洗酒精脱色番红复染水洗干燥观察,10.11.2022,35,（二）、电子显微镜的制样 样品在进行电镜观察前必须进行固定和干燥，制样时一般采用重金属盐染色或喷镀，提高在电镜下的反差。,10.11.2022,36,1、透射电镜的样品制备,负染技术,投影技术,超薄切片技术,冰冻蚀刻技术,10.11.2022,37,负 染 法,将样品的背景染色以凸现样品，所以称为负染法。,一般是采用电子密度高，本身不会显示任何结构，又和样品不起反应的物质，如磷钨酸的钠盐将样品包围，同时染色剂还会进入观察对象的内部，这样，既能显示外形，又可在一定程度上反映样品的内部
8、结构。,负染法原理,10.11.2022,38,负染色法观察的鞭毛,用途：可以观察细菌细胞、病毒等。,10.11.2022,39,在真空条件下，用电子散射能力强的重金属原子来喷镀样品表面，这样在样品和没有喷镀的区域形成了较强的反差，而没有喷镀的部分成了样品的投影，根据投影了解样品的立体形状、高度。,投 影 法,10.11.2022,40,投影法观察的噬菌体,用途：观察细菌的鞭毛或病毒的颗粒,10.11.2022,41,这是最常用的方法，可以观察细胞或其它样品内部的细微结构。样品固定脱水包埋切片。只有在20100纳米厚度的切片用透射电子显微镜才能观察，所以一般细菌样品，一个细胞要分割成10片到5
9、0片。,超 薄 切 片 法,超薄切片法观察的一种厌氧弧菌,10.11.2022,42,样品-196迅速冷冻加温到-100切割样品升华(真空)掉断口处的冰重金属喷镀断口表面电子显微镜观察,冰冻蚀刻法,10.11.2022,43,冰冻蚀刻法制备的酵母菌内部结构图,优点:可以避免在固定、脱水和包埋过程中造成细胞结构的人为改变而形成的假象。,10.11.2022,44,2、扫描电镜样品的制备,样品先要经过固定、脱水等处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子。,10.11.2022,45,扫描电子显微镜拍的葡萄球菌的表面,人类血细胞SEM照片,10.11.2022,46,作 业,1、透射电镜样品制备的方法有哪些？各自的适用范围有什么不同？,
