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1、第十八章 分子标记辅助选择育种,选择：是指在一个群体中选择符合育种目标要 求的基因型,我们还记得作物育种的任务吗？,按照人们的预定目标，采取相应的育种程序和方法，诱发、创造和重组遗传变异，选育出适应当地自然气候条件，符合社会、生产需要，在遗传组成上相对稳定一致的优良基因型，并繁育出足够数量个体（种子苗木）供生产上应用。,完成作物育种的任务主要取决于以下三个方面,1.亲本，亲本中必须包括育种目标所需的基因资源，并且这种基因资源是可供育种家方便利用的2.采用合理先进的育种方法，将优良基因重组在一起3.准确、可靠的鉴定技术，把优良基因型挑选出来并鉴定出它在一定的自然气候条件、生产条件下的适应能力和生
2、产潜力,在育种实践中经常可以看到这种情形：,采用两个相同的亲本进行杂交，从同一杂交组合中有人选出了品种，而有些人则一无所获。为什么？道理很简单，每个亲本有许许多多性状，两个亲本杂交，其后代可出现成千上万种基因组合。如何将最好的基因型挑选出来，这不仅取决于育种家的理论知识和正确的育种方案，更重要的是育种家敏锐的眼光和育种经验。与此同样重要的是还需要具备使优良基因型充分表达的外界环境条件。,各种性状的选择鉴定主要靠当地天然环境条件和多年多点试验，对病虫害和旱涝、盐碱抗性常靠人工诱发鉴定和连续多代表型选择。而不同年份、不同地点、不同田块甚至于同一田块中的不同部位，条件总不会完全相同，这势必影响实验的
3、客观性、公正性可和可重复性。为提高选择效率，加快育种进程，育种家们想方设法探究基因型与表型之间的关系，研究各种性状之间的相关，寻找准确可靠的鉴定方法和最佳选择方法。,近十年来，分子生物学技术的发展为植物育种提供了一种基于DNA变异为基础的新型遗传标记，与形态标记、细胞学标记和生化标记相比，是从基因型选择基因型。 RFLP RAPD SSR AFLP,第一节 遗传标记概述,一、遗传标记概念 遗传标记(Genetic markers): 是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。具有可遗传的、特殊的、易于识别的表现形式。,二、遗传标记应具备的条件：1.多态性高2.表现共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合
4、基因型3.对主要农艺性状影响小4.经济方便，容易观察记载,三、遗传标记种类,1.形态标记形态标记：即植物的外部形态特征。指那些能够用肉眼明确观测的一 类外观特征性状。形态标记性状： 植株高矮、粒型、粒色、穗 形、白化、 变态叶、矮秆、紫鞘、卷叶等； 也包括色素、生理特性、生殖特性、 抗病虫性等有关的一些特性。,2.细胞学标记(cytological markers)细胞学标记： 即植物细胞染色体的变异，指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体结构特征：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。核型特征：是指染色体的长度、着丝粒位置和随体有无
5、等，由此可以反映染色体的缺失、重复、倒位和易位等遗传变异。带型特征：是指染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等，由此可以反映染色体上常染色质和异染色质的分布差异。,染色体数量特征： 是指细胞中染色体数目的多少，染色体数量上的遗传多态性包括整倍性和非整倍性的变异。整倍性的变异：多倍体。非整倍性的变异：缺体、单体、三体、端着丝点染 色体等,3.生化标记：指以基因表达的蛋白质产物为主的一类遗传标记系统。 主要包括贮藏蛋白、同工酶、等位酶等标记。,分析方法：从植物组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。,4.分子标记(molecular mar
6、kers)分子标记：是DNA水平上的遗传多态性，表 现为核苷酸序列的任何差异。,DNA分子水平研究,优点：直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，而且不受环境限制，不存在是否表达的问题；数量多，遍及整个基因组，检测位点近乎无限，DNA标记在数量上几乎是无限的；多态性高，自然界存在着许多等位变异，不需要专门创造特殊的遗传材料；表现为“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多分子标记表现为共显性，能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息。,DNA分子标记技术大致可分为三类：第一类：以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术。 包括RFLP
7、、DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）等；第二类：以DNA聚合酶链式反应 (PCR， Polymerase Chain Reaction)为基础的分子标记技术。 包括RAPD、简单序列重复标记SSR、序标位STS、序列 特征化扩增区域SCAR等；第三类：以 DNA测序为核心的分子标记技术。 如：SNP标记、表达序列标签EST标记等；,第二节 分子标记技术类型及原理,一、 RFLP限制性片段长度多态性 (RFLP)是发展最早的分子标记技术。,RFLP是不同物种、品种甚至个体间DNA经核酸限制性内切酶酶切后产生的片段长度的差异 这种差异可以通过DNA凝胶电泳的方法直接观察到。,基
8、本步骤,用DNA限制性内切酶消化,Southern杂交,放射性自显影或酶学检测,DNA提取,凝胶电泳分离，转移到滤膜上,RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶酶切位点的增加或丧失，从而产生限制性片断长度多态性。,二、基于技术的分子标记,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外快速扩增DNA的方法 。 PCR反应包括三个步骤： 变性：在94-95使模板DNA的双链变性成单链。 复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在50-60 延伸：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72合成模板DNA的互
9、补链 这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有25-35个循环。,1、RAPD标记的基本原理,RAPD应用了PCR反应的原理，以不同的基因组DNA为模板，以单一的随机寡聚核苷酸（长度多为10个核苷酸）为引物而获得的一定扩增产物。由于不同基因组DNA序列存在着差异，其不同区段上可与引物同源互补的位点不同，扩增产物的数量、大小也不同，因而表现出多态性。这些DNA片段鉴定后证明可以作为分子标记的则称之为RAPD标记。,2.SSR标记的原理,根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，从而表现出不同个体在同一个微卫星座位上微卫星的长度多态性。,三、基于
10、DNA芯片技术的分子标记,单核苷酸多态性 (singlenucleotide polymorphism，SNP)：是指不同个体基因组DNA序列之间单个核苷酸的差异。就两个序列的比较而言，可指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等； 就遗传群体而言，指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的核苷酸且其出现频率大于1%（若出现频率低于1%，则视为点突变，是不可能作为标记的）。 它又被称为第三代新型多态性标记。通常我们所说的SNPs包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入缺失（Indel）目前，检测SNP的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片技术。 DNA芯片又称生物集成模片、
11、DNA阵列或寡核苷酸微芯片。,第三节 分子标记辅助选择,一、什么是分子标记辅助选择？,借助分子标记对目标性状基因型进行选择，这就是所谓的“分子标记辅助选择”（marker-assisted selection，缩写为MAS）。,广义而言，分子标记辅助选择不仅包括利用分子标记进行优异种质的鉴定筛选、（自交系）亲本间的亲缘关系分析、遗传多样性的保持和利用，而且包括利用分子标记选择、转移、聚合目标基因等育种的其它诸多环节，如植物系统发育关系分析、品种注册、专利保护、体细胞杂种鉴定、新品种权保护等。,二、分子标记辅助选择的优越性 在传统育种中，选择的依据通常是表现型而非基因型。这是因为人们无法直接知道
12、个体的基因型，只能从表现型加以推断，也就是说，传统育种是通过表现型间接对基因型进行选择的。理论上，利用分子标记可从DNA水平上直接鉴定基因型的差异，因此，避免了表现型推断基因型不准确等缺点。MAS的优越性可以体现在以下方面：,（1）克服性状表现型鉴定的困难：有些性状的表现型鉴定相当麻烦，在度量技术上难度较大、程序繁琐或因需要特定的仪器和设备，费用太高。（2）允许早期选择：在育种中，某些性状表现出来需要特定的生长环境和一定生长周期。因此，在对这些性状鉴定时必须考虑其表达的环境和等待一定生长时期，有时需要异地加代和特异的环境条件等。用标记鉴定基因型，将不需考虑（或等待）植株生长状况或环境条件，可以
13、在早期对幼苗（甚至对种子）进行检测。,（3）控制单一性状的多个（等位）基因的利用：在不同育种材料中，影响同一性状（如抗病、品质）的基因可能有多个，特别是在同一位点上存在不同（复）等位基因，利用表型是很难鉴定出这些等位基因的。（4）允许同时选择多个性状：育种目标性状往往需要综合考虑，也就是说，当选单株或品系不仅要在单一的抗病、抗虫、品质、产量等方面表现优良，而且在综合性状上应该比较优良，为此，需要对育种世代群体的每个目标性状一一作鉴定筛选。,（5）可进行性状非破坏性评价和选择：很多性状是在成熟前进行评价的，这往往带来种子收获的困难。如对植株进行病虫害抗性的评价，涉及到接种、饲喂幼虫等环节，对植株
14、生长有较大影响，严重时往往造成收获到的后代种子减少，甚至收获不到种子。,（6）从育种进程考虑，可加快育种进程，提高育种效率： 针对有利基因为隐性的性状，如果将有利的隐性等位基因从一个亲本导入到优良亲本中时，常规表型育种往往是通过选择保留含有隐形基因的杂合基因型，作进一步回交，而杂合基因型鉴定通常是通过考察自交后代分离状况来判断，而且当选择的是抗病性状时，还要借助繁琐的接种鉴定等，这样会延迟育种进程。分子标记辅助选择则不受上述限制条件的影响。,第四节 分子标记辅助选择育种,一、分子标记辅助选择育种 利用与目标性状基因紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行基因型选择的一种现代育种方法。,二、分子标
15、记辅助选择育种的遗传基础,1.分子标记辅助选择的根据 借助分子标记对目标性状的基因型进行选择，主要是根据与目标基因的紧密连锁的对分子标记基因型的检测来推测、获知目标基因的基因型。2.应具备的主要条件（1）与目标基因紧密连锁的分子标记。（2）进行分子标记辅助育种需要建立饱和的分子标记图谱 并把目标基因定位于分子图谱上。（3）简便快捷的标记检测方法。,3.分子标记辅助选择育种的基本程序：第一步，目标基因的精细定位，要求目标基因有一个 与其紧密连锁的分子标记，并且目标基因座位与分子标记座位之间的遗传距离小于5cM；第二步，采用RFLP、RAPD、AFLP、SSR等分子标记进行多态性检测；第三步，利用
16、计算机分析多态性；第四步，应用RFLP、RAPD、AFLP、SSR等标记针对育种群体进行分子标记辅助选择。,4.什么是背景选择、前景选择？ 前景选择(foreground selection)： 标记辅助选择的主要方面是对目标基因的选择，有人称之为前景选择。 前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连锁的紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密，才能够达到较高的正确率。,背景选择 (background selection)： 除了目标基因之外，对基因组中其他部分（即遗传背景）作选择。 背景选择与前景选择不同的是选择的对象几乎包括了整个基因组，牵涉到一
17、个全基因组选择的问题。 背景选择的作用则是为了加快遗传背景恢复成轮回亲本基因组的速度，以缩短育种年限。,玉米分子标记连锁图谱(1-5),玉米分子标记连锁图谱(6-10),（5）产量性状QTL分析单位点QTL分析,玉米产量性状QTL分布（1-5染色体）,玉米产量性状QTL分布 （6-10染色体）,目标基因的标记筛选（gene tagging）是进行分子标记辅助选择（MAS）育种的基础。用于MAS育种的分子标记须具备三个条件：,分子标记与目标基因紧密连锁标记实用性强，重复性好，而且能够经济简便地检测大量个体。不同遗传背景选择有效。,三、目标基因的标记筛选,供体,受体,RR Rr rr (1-p)2
18、 2p(1-p) p2,MR,mr,MR,mr,目标基因与DNA标记间的遗传距离位p,亲本中DNA标记的带型,F1杂种中DNA标记的带型,在F2分离群体中分子标记类型即MM,Mm,mm,MM类型的分子标记所代表的目标基因型及其频率,利用MAS的遗传基础（以RFLP为例）,M抗性标记 R抗性基因m感病标记 r感病基因,第五节 分子标记辅助选择育种的策略,受体亲本 供体亲本 (不含优质基因) (含优质基因),F1 受体亲本,BC1,目标基因定位,标记辅助选择,中选BC1 受体亲本 (含优质基因),BC2,BC3,标记辅助选择,标记辅助选择,中选BC3(含优质基因),新育成的优质品种(受体亲本遗传本
19、背景+优质基因),自交,目标基因的定位与标记辅助回交育种相结合程序图,中选BC1 受体亲本 (含优质基因),受体亲本 供体亲本A(无优质基因) (含优质基因A),受体亲本 供体亲本B(无优质基因) (含优质基因B),F1(含优质基因A) F1(含优质基因B),复杂杂种(分离群体),受体亲本 供体亲本C(无优质基因) (含优质基因C),中选杂种个体 F1 (含优质基因A和B) (含优质基因C),复杂杂种(分离群体),中选杂种个体 受体亲本(含优质基因A、B和C),新育成的优质品种 (受体亲本遗传背景+优质基因A、B和C),回交12代，标记辅助选择,自交,标记辅助选择,标记辅助选择,标记辅助基因聚
20、合,与品质改良相结合程序图,分子标记辅助选择抗病基因Xa21的育种策略,利用分子标记辅助选择奖IRBB21中抗病基因Xa21导入到优良恢复系明恢63，目的在于不改变明恢63的配合力和重要农艺性状的前提下，增强其对白叶枯病的抗性,明恢63 IRBB21（Xa21）,明恢63F1,明恢63BC1F1 （MAS筛选Xa21一侧具有交换的阳性单株）,明恢63BC2F1 （MAS筛选Xa21另一侧具有交换的阳性单株）,BC3F1 （MAS选择背景同明恢63的单株）,BC3F2 （Xa21）（选Xa21纯合，背景与明恢63完全一致的单株）,明恢63 （Xa21）（改良明恢63,第六章 分子设计育种,我想让
21、你长什么样就长什么样,一、分子设计育种的概念,它以生物信息学为平台，以基因组学和蛋白组学等若干个数据库为基础，综合作物育种学流程中的作物遗传、生理、生化、栽培、生物统计等所有学科的有用信息，根据具体作物的育种目标和生长环境，在计算机上设计最佳方案，然后开展作物育种试验的分子育种方法。,分子设计育种,二、分子设计育种的特点,1.能提高效率，能够定向育种 与常规育种方法相比，作物分子设计育种首先在计算机上模拟实施，考虑的因素更多、更周全，因而所选用的亲本组合、选择途径等更有效，更能满足育种的需要，可以极大地提高育种效率。,2.是一个结合多学科的系统工程 分子设计育种在未来实施过程中将是一个结合分子
22、生物学、生物信息学、计算机学、作物遗传学、育种学、栽培学、植物保护、生物统计学、土壤学、生态学等多学科的系统工程。,3.能够实现由表现型选择到基因型选择 传统的杂交育种都是育种专家根据育种材料及其后代的“外貌”（即表型性状），在田间直接选择的。 分子育种是通过分子技术对育种的目标基因和目标性状进行转移和选择，进而培育出优良的新品种，通俗说法就是在分子水平上进行育种操作。 使用分子育种技术可以不受外界环境条件的影响，在实验室内直接对控制目标性状的基因进行选择，它代表着作物育种的发展方向。,三、作物分子设计育种相关基础研究现状及发展趋势,近年来，主要作物的基因组学研究，特别是拟南芥、玉米、水稻和小麦基因组学研究取得了巨大成就，基因定位和QTL作图研究为分子设计育种奠定了良好基础，计算机技术在作物遗传育种领域的广泛应用为分子设计育种提供了有效的手段。,1.生物信息学遗传信息数据库中的数据呈“爆炸式”增长欧洲生物信息研究所EMBL数据库美国国家生物技术信息中心GeneBank数据库日本国立遗传学研究所DDBJ数据库,
