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1、细胞传代培养及细胞计数,人癌细胞系传代培养,1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染；2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体；3. 漂洗：加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消化液；4. 消化：再加1ml消化液漂洗1次,倒掉大部分消化液, 保留约0.3ml,室温放置35min；5. 吹打：镜下看到细胞收缩变园, 加12ml含血清培养液, 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫；6. 计数：取样,计数,调整细胞浓度；7. 接种及培养：按104 细胞/ml接种,37、5%CO2 ，饱和湿度条件下培养。,注意事项,细胞生长至覆盖培养瓶底面积80%左右时,开始传代。首次传代
2、培养应适当提高接种细胞浓度。细胞混杂生长时, 可根据需要选择合适的方法纯化细胞。,血球计数板法,制备细胞悬液：细胞密度104/ml, 细胞过多时需适当稀释,单个细胞率95%。加样：混悬细胞，取少许细胞悬液，从计数池一侧加入，不要溢出或出现气泡。计数：10倍物镜下计数四角大方格内的细胞，压线者只计左边线和上边线。计算：细胞数/ml=（四大格细胞总数4）104稀释倍数,细胞活力测定台盼蓝染色法,制备单个细胞悬液：105106ml染色：0.04%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液1滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染料拒染）和死细胞（呈淡蓝色）计算细胞活
3、力： 活细胞率（）活细胞数（活细胞数 死细胞数）100,细胞密度调整,稀释公式：C1V1C2V2稀释前细胞密度C1，溶液体积V1稀释后细胞密度C2，溶液体积V2,细胞计数,106/mlCell susspension,105/ml,104/ml,103/ml,0.1ml,0.1ml,0.1ml,Medium 0.9ml,细胞生长曲线测定计数法,DT = t lg2 (lgNtlgNo),培养细胞的纯化方法,机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞密度梯度离心法：细胞漂浮密度， Ficoll, Percoll克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术电泳分离法：细胞表面电荷,细胞培养过程中常见的问题,培养液pH值快速偏离 ：CO2浓度异常，培养瓶盖过紧 ；细菌、酵母或霉菌污染 培养液出现沉淀 ：细菌或霉菌污染细胞不贴壁 ：胰酶过度消化细胞 ，支原体污染 ，缺乏附着因子,细胞死亡 ：孵箱中缺CO2 ， 孵箱温度不稳定 ，细胞冻融损伤 ，渗透压改变，培养液中毒性代谢产物堆积 细胞生长缓慢 ：培养液或血清改变 ，基本促生长成分的消耗、缺乏或降解,如谷氨酰胺、生长因子等 ，低水平的细菌或霉菌污染，接种细胞数太少 ，有限培养细胞衰老 ，支原体污染,谢谢！,
