荧光定量PCR原理扩增曲线ppt课件.ppt

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1、荧光定量PCR技术专题,内容概要,荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR解析方法 SYBR法实验流程及注意事项TIANGEN公司荧光定量产品选择指南,实时定量PCR技术:利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析,与常规 PCR技术比较:对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析,无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测,荧光定量PCR原理定义,扩增曲线 荧光阈值 Ct值,荧光定量PCR原理常用名词概念,Cycle(循环数),Rn(荧光强度),Baseline,Logliner phas

2、e,Logliner phase,荧光定量PCR原理扩增曲线,Cycle(循环数),Rn(荧光强度),Baseline,Logliner phase,Logliner phase,前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline) 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置:大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值;进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过域值,Threshold,荧光定量PCR原理荧光域值,Ct值的定义: PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Cycle(循环数),Rn(荧光强度),Ct value,荧光定量

3、PCR原理Ct值,Cycle number,Ck 104,Ck 102,Sample,Log of DNA concentration,模板DNA量越多,荧光达到域值的循环数越少,即Ct值越小。 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。,荧光定量PCR原理Ct值与模板起始量的关系,线性关系、扩增效率确认,检测灵敏度确认,No template control确认,PCR扩增效率(E):0.8-1.2,35Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法,30Cycles内无非特异性产物扩增,35 Cycles内无引物二聚体产生,相关系数(r2):大于0.98,荧光定量PCR反应性的确认,

4、定性分析研究:杂合或纯合子鉴定,(SNPs)分析等 绝对定量研究:病毒和病原菌定量分析,基因拷贝数定量, GMO定量检测等 相对定量研究:mRNA表达量分析,siRNA效果确认,基因芯片结果验证,差异显示结果验证等,荧光定量PCR技术的应用,内容概要,荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR的解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南,非特异性荧光标记 SYBR Green I特异性荧光标记 TaqMan Probe,常用荧光标记方法,SYBR Green I染料法原理,SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的

5、具有绿色激发波长的染料。,SYBR Green I,热 变 性,引物退火,延伸反应,SYBR Green I染料法作用机理,问题点: SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光,因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生,也将 同时被检测,从而可能导致检测结果不准确。,SYBR Green I染料法问题点与关键点,关键点: 设计合适引物,防止非特异性扩增!,将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT),原始图谱,对数图谱,SYBR Green I染料法融解曲线,SYBR Green I染料法融解曲线,对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA 使用方便,不必设计复杂 探针

6、具有价格优势,优 点,容易与非特异性双链DNA结合,产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析,优化反应条件 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量,缺 点,SYBR Green I染料法优缺点,Taqman探针法原理,5端标记有报告基团(Reporter, R) ,如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整,R发射的荧光能量被Q基团吸收 ,无荧光, R与Q分开,发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性,可水解探针,Taqman探针法工作机理,1、引物、探针的设计: 探针Tm为68-70 ,30 bp, 5不能有G,G可能会淬灭荧光素, 引物尽量靠近探针,扩增片段

7、400 bp,引物Tm为59-60 2、反应参数的确定: 一般为:94 ,10-20S 60,30-60S(Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高),也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度:获得最小Ct值,最大信号/背景比值 引物浓度:50-900nM 探针浓度:50-250nM4、其他与常规PCR相同,Taqman探针法PCR体系的建立,Taqman探针法荧光标记物的选择,高度特异性 重复性好 可进行多重定量,优 点,只适合一个特定的目标 委托公司标记,价格较高 不易找到本底低的探针,缺 点,Taqman探针法优缺点,不同定量方法的比较,内容概要,荧光定量PCR原理 荧光定量P

8、CR的标记方法 荧光定量PCR的解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南,绝对定量解析方法,绝对定量的定义,Log(起始浓度)与循环数呈线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值,就可以计算出样品中所含的模板量,质粒标准品的制备,PCR,目的基因克隆,质粒提取,OD值定量,将质粒梯度稀释作为标准品使用,目的基因,目的基因,目的基因,质粒,目的基因,基因组DNA,拷贝数的计算:待测样本浓度(ng/ul)OD26040稀释倍数样本分子量=碱基数324待测样本拷贝数(copies/ul)=待测样本浓度/样

9、本分子量61014,倍比梯度稀释方法:1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液,得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液,得标准品iii1v标准品iii +9v稀释缓冲液,得标准品iv1v标准品iv +9v稀释缓冲液,得标准品v,质粒标准品稀释方法与拷贝数计算,方 法:从血液中提取病毒DNA,以TaqMan探针法进行荧光定量检测 试 剂:TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix(Probe)(目录号:FP203) 标准品:质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 ;2个重复;设阴性空白对照 实验步骤:提取HBV DNA; 设计特异引物; 设计TaqMan探针并标记探针

10、; 荧光定量扩增; 结果分析:获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。,绝对定量实验例乙肝病人血液中HBV的绝对定量,实验数据,绝对定量实验例乙肝病人血液中HBV的绝对定量,扩增效率(E)计算 E=10-1/斜率 1 =10-1/-3.17 1 =2.031 1.03,标准曲线制作:利用Mean Ct 作图可得到标准曲线,y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988,绝对定量实验例乙肝病人血液中HBV的绝对定量,相关系数(R2):大于0.98,越接近1,结果可信度越高。 扩增效率(E):0.8-1.2, 越接近1,越理想。,未知样品拷贝数的计算,将Ct值带入线性方程:,2

11、0.5= -3.1726 X + 37.52,QuantityUnknown=105.36 =229087 copies,绝对定量实验例乙肝病人血液中HBV的绝对定量,相对定量解析方法,相对定量的必要性,以上条件不可能同时得到满足,必须用内对照基因(管家基因)进行校正,进行相对表达量分析。,管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如:GAPDH、Actin、18S rRNA等,筛选方法,根据文献提供 通过具体实验筛选,相对定量分析管家基因筛选,双标准曲线法 2 -Ct法,相对定量分析两种常用的分析方法,通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量,然后根据计算公式求得相对

12、值即为相对表达量。,相对值=,校正值=,目的基因定量结果,管家基因定量结果,待测样品的校正值,对照样品的校正值,相对定量分析双标准曲线法,公式:,优点:分析简单,实验优化相对简单缺点:对每一个基因,每一轮实验都必需做标准曲线应用:基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,相对定量分析双标准曲线法,实验数据,公式:,F =,2,相对定量分析2 法,优点:无需作标准曲线缺点:假定扩增效率为 100 %; 假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致; 实验条件优化较为复杂应用:基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,Ct,实验数据:,Sample,处理前,处理后,Jun(

13、MeanCt),GAPDH(MeanCt),E,1816,1717.4,1.951.95,2 - Ct法:假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%,Ct(处理前)18171 Ct(处理后)1617.4=1.4Ct=Ct(处理后)Ct(处理前)1.412.4比率(处理后/处理前)=2Ct2(2.4) = 5.3 所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高5.3倍,修正方法:如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率,但扩增效率不等于2,那么2Ct可以修正为:ECt,例如扩增效率为1.95,那么计算公式可修正为1.95Ct,相对定量分析2 -Ct法,内容概要,荧光定量PCR的原理 荧光定量P

14、CR的标记方法 荧光定量PCR的解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量相关产品,SYBR法实验流程及注意事项,样品制备,模板准备,引物设计,反应条件优化,浓度确定,技能要求,环境要求,误差控制,数据分析,仪器介绍,RT,上机,反应体系优化,试剂选择,分析方法,样品制备,环境要求,模板准备,数据分析,RT,上机,浓度确定,SYBR法实验流程及注意事项,RT,反应体系优化,试剂选择,样品制备,模板准备,数据分析,上机,SYBR法实验流程及注意事项,模板准备,引物设计,浓度确定,环境要求,误差控制,RT,样品制备,数据分析,上机,反应体系优化,上机,反应条件优化,RT,样

15、品制备,模板准备,数据分析,SYBR法实验流程及注意事项,标准品,待测样本,阳性对照,阴性对照,技能要求,误差控制,仪器介绍,上机,试剂选择,RT,样品制备,模板准备,数据分析,SYBR法实验流程及注意事项,Rotor-gene6000,MiniOpticon,Mx3005PTM,LINE-GENE FQD-66A,ABI PRISM 7500,iQ5 Real-Time PCR Detection System,数据分析,仪器介绍,分析方法,上机,RT,样品制备,模板准备,相对定量:2Ct法绝对定量:标准曲线法,可靠,准确的数据,SYBR法实验流程及注意事项,内容概要,荧光定量PCR的原理

16、荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR的解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量相关产品,TIANGEN公司荧光定量产品,SYBR Green法,探针法,FP203RealMasterMix (Probe),以DNA为模板,FP202 RealMasterMix (SYBR Green),以RNA为模板,FP302 Quant qRT-PCR(SYBR Green) Kit,FP303 Quant 一步法qRTPCR (SYBR Green),TIANGEN公司荧光定量产品优势,试剂盒中使用改良后的Hotmaster Taq Polymerase,具有高效率、高灵敏度、高特异性特点多种不同的实验缓冲液,满足不同实验需求高效的Quant系列逆转录酶,满足RT需求独特的Mg2自动调节,随时保证为PCR提供最佳Mg2浓度,谢谢!,

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