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1、第四章食品检验检疫新技术,2015-9-18,提 纲,概述,一,免疫学检测技术,二,核酸提取方法与探针技术,三,四,基因芯片技术,五,生物传感器,六,第一节 概述,一.概述,老方法费时费力，精确性不高,新方法快速、可靠,为什么要发展新方法？,现代免疫技术,核酸探针技术,现代免疫技术,生物传感器,基因芯片技术,PCR技术,自动微生物鉴定系统,第二节 免疫学检测技术,一.免疫学检测方法的原理,抗原：能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与之结合引起特异性免疫反应的物质。,抗原性,反应原性,免疫原性,能与相应抗体结合发生反应的特性,刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的特性,不完全抗原（半抗原）,抗体：在
2、抗原刺激下产生，并能与之特异性结合的免疫球蛋白。,血清学试验：因为抗原抗体反应一般都要用血清，所以把抗原抗体在体外发生的特异性结合反应称血清学试验。,免疫学检测方法的原理：借助抗原和抗体在体外特异性结合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。,定性,有免疫复合物形成的现象发生,定量,反应中加入抗原或抗体的浓度与形成免疫复合物的浓度成函数关系。根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原或抗体的含量。,免疫单向扩散,当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出
3、现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。,免疫比浊法,酶联免疫检测,ELISA,酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）,Elisa Swan,Hikari Elisa,二.ELISA快速检测方法,（一）基本原理,酶标抗体,酶标抗原,抗原吸附在固相载体上，加待测抗体，再加相应酶标记抗体，生成抗原一待测抗体一酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有
4、色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。,酶联免疫吸附试验,（二）ELISA的种类,直接法、间接法、夹心法、竞争法,（三）用于标记的酶,常用的有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶,常用的交联方法有戊二醛法、过碘酸氧化法,（四）酶与底物,辣根过氧化物酶,联苯二胺（OPD）3,3 ， 5,5 -四甲基联苯胺,显色,（五）固相载体,ELISA小试管,聚苯乙烯材料,ELISA小珠,聚苯乙烯材料,ELISA酶标板,聚苯乙烯材料,硝酸纤维素膜,磁性微粒,（六）ELISA的测定方法（视频）,三.免疫层析条检测方法,免疫胶体金层析条,脂质体层析条,脂质体中含有染料等其他可见的化合物。脂质体结构的外膜表面有抗体
5、附着，若被检食物中存在病原体，后者就结合在抗体上，使脂质体的外膜破裂，从而释放出染料或其他标记物。,四.试剂盒快速检测方法,试剂盒，装试剂的盒子。将实验所需的众多试剂组合到一起，并对每一步实验操作给予详细的说明，使用者只要按操作步骤添加试剂即可。,第三节 核酸提取方法与探针技术,一.核酸的提取方法,课本上有个地方有问题,二.探针种类及其制备方法,（一）探针的标记物分类,（二）探针的标记方法,缺口平移法,随机引物法,PCR标记法,三.核酸探针杂交技术,（一）异相杂交,即固-液相杂交,一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或
6、其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，,southern印迹杂交,Edwin Mellor Southern,三.核酸探针杂交技术,（二）同相杂交,即液-液相杂交,双探针常规技术,5,3,供能,发光,自由状态时，分子信标呈发卡式结构，从而荧光基团和淬灭基团相距较近。此时使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭。当分子信标与靶分子结合时，荧光基团和淬灭基团之间的距离加大，从而使分子信标的荧光几乎100%恢复。所检测到的荧光强度与溶液中靶标量成正比。,分子信标技术,第五节 基因芯片技术,一.基因芯片概述
7、,基因芯片的定义：将多个DNA探针固定在很小面积的固相载体上所组成的微点阵阵列，可与来自样品的互补核酸片段杂交。基因芯片技术实际上是高度集成化的反向斑点技术。,二.基因芯片的制作和分析步骤,多聚赖氨酸处理的目的防脱,基因芯片系统,三.基因芯片在转基因食品检测中的应用,第六节 生物传感器,一.生物传感器概述,生物传感器的定义将含有固定化生物活性物质（如酶、抗体、全细胞、细胞器或其联合体）做敏感元件，配上适当的换能器所构成的分析系统，称为生物传感器，它可以将生化信号转为数量化的电信号。,二.生物传感器的工作原理,（一）将化学变化转变成电信号（二）将热变化转变成电信号（三）将光信号转变为电信号（四）直接产生电信号,汗水传感带,它通过测量汗水中分泌的代谢物质，让使用者能跟踪自身的电解质平衡、水化程度、肌肉劳累度和身体活动能力等。,
