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1、蛋白的酵母双杂交实验原理及其应用,汇报人：段志强2011年1月21日,DNA,RNA,蛋白质,表现催化活性,转录,逆转录,翻译,复制,中心法则,基因是相对静态的，而基因编码的产物蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是细胞活性及功能的最终执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。,为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好
2、地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。研究蛋白质相互作用的方法也就具有更为重要的意义。,酵母双杂交系统,一、酵母双杂交系统的实验原理二、酵母双杂交系统中各表达载体 的构建及实验方法三、酵母双杂交系统的应用,一 酵母双杂交系统的实验原理,蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。很早就知道，转录活化蛋白可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个独立的结
3、构域，即DNA结合结构域（Binding Domain，BD）和转录活化结构域（Activation Domain，AD）分别来完成，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的（见图1）。,图1 转录因子活化示意图,以Gal4蛋白为例,目前使用的酵母双杂交系统有LexA系统和Gal4系统两种：1、LexA系统。BD由一个完整的原核蛋白LexA构成，AD由一个88个aa的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录；2、Gal4系统。BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域（1-147aa与768-881aa）构成。,在利用Gal4系统筛选cDNA文库或研究蛋白间的相互作用
4、时，BD与靶蛋白即“诱饵蛋白”结合，AD与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。在BD与AD要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在Gal4 UASs和启动子的下游构建3个报道基因-ADE2、HIS3、MEL2（或LacZ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用（见图2）。,图2 酵母双杂交系统的工作原理,pGADT7,pGADT7,二 酵母双杂交系统中各表达载体的构建及实验方法,酵母双杂交系统的构建包括诱饵蛋白（BD）表达载体的构建和细胞cDNA文库的构建（含AD表达载体）。1、诱饵蛋白表达载体的构建,SD/-Trp/K+,制备酵母感受态细胞AH1
5、09或Y187,END?,转化酵母细胞,检测诱饵表达载体对报道基因的自激活以及诱饵蛋白对宿主菌的毒性：（1）自激活的检测 将鉴定的阳性单克隆在SD/-Trp/x-Gal、SD/-Ade-Trp/x-Gal 、SD/-His-Trp/x-Gal、SD/-Trp-Leu/x-Gal平板上划线，观察菌落的生长情况和颜色变化。（2）毒性的检测 挑取一个直径2-3mm的克隆于5mL SD/-Trp液体培养基中培养过夜，检测其OD600nm。若OD600nm0.8，表明没有毒性；若OD600nm0.8，表明诱饵蛋白对酵母细胞有毒性。 只有当诱饵表达载体对报告基因无自激活作用，同时诱饵蛋白对宿主细胞无毒性作
6、用时才能用于酵母双杂交实验。否则只能重新构建诱饵表达载体。,2、细胞cDNA文库的构建（含AD表达载体） 目前酵母双杂交系统使用的含AD表达载体的细胞cDNA文库，构建方法是利用CLONTECH公司SMART技术先将细胞总RNA或mRNA合成ds cDNA，然后将ds cDNA与线性穿梭载体pGADT7-Rec共转化酵母细胞，在酵母细胞内利用同源重组形成完整的文库质粒，再通过营养缺陷培养基（SD/-Leu）筛选得到cDNA文库质粒。,SMART技术合成ds cDNA,在酵母体内利用同源重组形成完整的文库质粒,3、从cDNA文库筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白方法1：将转化诱饵表达载体的酵母AH10
7、9（或Y187）与含有文库质粒的酵母Y187（或AH109）进行mating，然后将mating产物涂SD/-Trp-Leu平板。随后挑取直径在2-3mm的菌落划线接种在SD/-Ade-His-Trp-Leu/X-Gal平板，变蓝色的菌落再次划线SD/-Ade-His-Trp-Leu/X-Gal平板，最后提取蓝色菌落的质粒，经转化Ecoli扩增后，测序，进行Blast分析（见图3）。方法2：提取cDNA文库质粒，将文库质粒与诱饵质粒共转化酵母细胞AH109，然后将转化产物涂SD/-Trp-Leu平板，（操作同上）。方法3：将ds cDNA，文库表达载体pGADT7-Rec，诱饵质粒pGBKT7
8、-X共同转化酵母AH109，然后将转化产物涂SD/-Trp-Leu平板，（操作同上）。,图3 诱饵蛋白筛选cDNA文库中相互作用的蛋白,如何验证筛选出的蛋白是否具有相互作用？,1、假阳性质粒的排除（回转验证）： 将鉴定的阳性质粒与诱饵质粒共转化酵母AH109,然后涂SD/-Trp-Leu平板，挑取直径2-3mm的菌落划线接种在SD/-Ade-His-Trp-Leu/X-Gal平板。生长2-4d后，如果菌落生长且变蓝，说明蛋白间有相互作用；如果菌落无生长且不变色，说明蛋白间无相互作用，即为假阳性质粒。2、体内外验证实验（1）GST pull down。（2）CO-IP。（3）细胞共定位。,三 酵
9、母双杂交系统的应用,酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。,1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 酵母双杂交技术已成为发现新基因的主要途径。用已知基因作诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白，再从酵母中分离得到AD-Library载体，对
10、其进行测序并在GenBank中进行比较，可以得到与已知基因在生物学功能上的联系。 Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 突触蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交系统从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1 与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个aa残基和Synphilin
11、-1的349-555个aa残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。,2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，研究抗原和抗体之间的相互作用。但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用，而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。 例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体
12、的三个可变区的基因分别被克隆在AD-Library载体上，将BD-Bait载体和每种AD-Library载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。,3、利用酵母双杂交系统筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响 酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。 例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶 NS3，以及细
13、胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。,4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图 众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系，通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列。 HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。 Dyer等通过酵母双杂交技术，绘制出了人与致病性细菌蛋白间相互作用的基因组蛋白网络连锁图，为深入研究人与致病菌间的相互作用关系奠定了基础（见图4）。,谢谢！ Thanks!,
