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1、蛋白质组学与分析技术（第 九 讲）,酵母双杂交技术基因敲除技术,酵母双杂交技术,主要内容,酵母双杂交概念酵母双杂交的基本原理酵母双杂交系统的优缺点酵母双杂交系统的应用酵母双杂交衍生系统酵母双杂交技术未来展望,什么是酵母双杂交？,酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid)，简称双杂交系统(Two-Hybrid System)，又称相互作用陷阱(InteractionTrap)，是1989年由Stanley Fields和Song等在验证两个蛋白质间相互作用的亲和力时初步建立的，并在Nature杂志上首先描述了这一系统，该系统是以酿酒酵（S.cerevisiae）为宿主，在酵母菌内研究蛋白质蛋
2、白质相互作用的一种分子生物学方法。酵母双杂交正成为探索蛋白质相互作用最常用和最有力的工具。目前已被广泛地应用于真核基因的表达与调控、细胞黏合因子间的相互作用、信号传导通路以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定与分离等诸多领域的基础研究及药物开发。,酵母双杂交的基本原理,酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录起始调控的认识。转录起始需要转录激活因子的参与，而真核生物转录激活因子大多是由结构上分离、功能上独立的两个结构域组成，即DNA结合结构域(DNA binding domain,简称为DNA-BD)和转录激活结构域(transcription activating domain,简称AD)。转录
3、激活蛋白可以和DNA上特异的序列结合，同时可启动相应因子的转录。它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DNA-BD和AD都不能激活转录起始。但不同转录激活因子的DNA-BD和AD形成的融合蛋白仍然具有正常的激活转录起始的功能。,结合结构域,与DNA结合结构域(DNA-BD)融合的蛋白一般称为“诱饵蛋白”(bait protein)与转录激活结构域(AD)融合的蛋白一般称为“猎物蛋白”(prey protein)或“靶蛋白”(target protein),诱饵蛋白,结合结构域,报告基因 mRNA,如果分别融合于DNA-BD和AD上的“诱饵蛋白”和“猎物蛋白”之间存在相互作用,那么DNA-B
4、D和AD就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活相应报告基因(reporter gene)的转录与表达。通过对报道基因表达产物的检测,反过来就可判别“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。,报告基因 mRNA,报告基因 mRNA,报告基因 mRNA,报告基因 mRNA,酵母双杂交系统的优缺点,1 酵母是真核细胞，表达的蛋白可保持天然状态在细胞中产生相互作用，一定程度上代表了细胞内的真实情况；2 易于转化、便于回收扩增质粒，3 采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料来构建cDNA文库，分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白；4 具有很多营养缺陷型标记和特
5、征报道基因,筛选方便；5 高度敏感性，可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时性的相互作用；6 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合，避免了对文库编码蛋白的干扰。,1 有些诱饵蛋白质本身具有激活转录功能使在无特异激活结构域情况下激活转录；2 有些蛋白通常在细胞表面发生相互作用，不能稳定地在酵母中表达或定位于酵母细胞内；3 有些DNA-BD融合蛋白或AD融合蛋白一部分可能封闭正常的作用位点，或者破坏了蛋白质的正确折叠，从而影响了蛋白间作用的能力；4 有些蛋白质的正确折叠、修饰和功能有赖于其它非酵母蛋白的辅助，这限制了某些胞外蛋白（如哺乳动物）和细胞膜受体蛋白等的研究；5 有些蛋白质本身对酵
6、母细胞具有毒性作用。,优势,局限性,酵母双杂交系统的应用,1 检验对功能已知蛋白间的相互作用 优点快速和高灵敏度，且反映了蛋白在体内的相互作用；还能检测出瞬间发生的信号反应，而用体外检测法检测蛋白要经过一系列洗涤过程，常致使相互作用不再发生。融合蛋白由于BD和DNA序列的相互作用而变得更加稳定。并且杂合蛋白一般都是由高拷贝质粒的强启动子过量表达的蛋白，在转录过程中产生了一些复合酶使信号得以放大。2 研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域 可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。利用此系统已分析和测定了多种重要的结构域，当证实了两个蛋白有相互作用后，可以对其进行缺失实验而找到相
7、互作用发生所必须的氨基酸残基。通过该方法还能研究蛋白质的结构与功能。通常需要对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。,3发现新的作用蛋白质 用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径，寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白，是双杂交系统最广泛和最有价值的应用。4 寻找具有药物治疗作用的小分子多肽 通过双杂交系统筛选和目标蛋白相互作用的多肽，如靶蛋白是药物设计的目标，则有可能得到一些具有药物治疗作用的小分子多肽药物。,5分析新基因的生物学功能 即以功能未知的新基因蛋白克隆在BD载体上，而把将要筛选的cDNA文库克隆在AD载体上，利用双杂交技术可以找到一个新的结合蛋白，这个结
8、合蛋白可能是已知基因也可能是未知基因所编码，然后根据调到的已知基因的功能推测该新基因的功能。6寻找调控蛋白相互作用的蛋白，在恢复转录活性的双杂交系统中加入某一分子化合物后再检测报告基因的表达强度，可用来寻找抑制蛋白质之间相互作用的小分子化合物。,7 蛋白质相互作用图谱的构建 随着基因组研究计划的开展，及mRNA在不同组织器官的不同发育阶段表达图谱的构建，蛋白在不同时空状态下相互作用图谱的构建也逐渐展开。酵母蛋白质相互作用的横向研究是近年来双杂交系统最引人注目的应用，用以揭示多种细胞活动过程中各控制因子间的联系。,酵母双杂交技术应用的趋势及展望,酵母双杂交技术问世至今十多年来，已经在蛋白质间的相
9、互作用研究、筛选新的蛋白、研究蛋白质的功能等诸多方面发挥了重要作用。该技术已经成为许多实验室研究蛋白质的相互作用和蛋白质的结构与功能的必备手段。目前除了应用双杂交系统继续寻找和靶蛋白起相互作用的新蛋白外，相当一部分的实验重点已放在如何利用双杂交系统作为媒介来研究蛋白相互作用的调控机制以及寻找蛋白联系图谱，这在后基因组时代更具意义。,交链孢菌植物激活蛋白信号传导机理的研究应用实例,利用酵母双杂交技术，即将交链孢菌植物激活蛋白目的基因克隆在DNA-BD载体上,将拟南芥cDNA文库或番茄cDNA文库克隆在AD载体上，在酵母中进行表达筛选，可得到目的基因的互作蛋白，然后针对互作蛋白进行植物激活蛋白信号
10、传导机理的研究。,技术路线图,酵母双杂交体系的实验程序,诱饵蛋白自激活作用检测,待筛cDNA文库片段克隆在AD质粒载体上,把cDNA文库质粒转化到含诱饵载体BD-X的感受态酵母菌内,检测挑选阳性克隆,酵母质粒DNA提取并转化大肠杆菌,提取细菌质粒酶切鉴定,明确与已知靶蛋白X相作用的Y蛋白的核苷酸序列,待筛cDNA文库 质粒的准备,将已知靶蛋白质X的编码基因插入BD质粒载体，构建诱饵载体,酵母双杂交衍生系统,单杂交系统（One-hybrid system）三杂交系统（Three-binding hybid system）反向双杂交系统（Reverse two-hybrid system）无核双杂
11、交系统（Non-nuclear two-hybrid system）,单杂交系统,单杂交系统是1993年发展出来的一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系，用于确定识别特异DNA结合蛋白。在该系统中，转录激活域AD相融合的待筛选蛋白质Y直接与DNA结合位点相结合，使AD直接激活启动子下游报告基因的表达。这一过程无需BD-X的参与，因而通过对AD-Y文库的筛选可分离出与靶DNA序列直接作用的蛋白质Y。,2 酵母单半杂交系统 酵母单半杂交系统(one-and-a-half hybrid system)也是一种筛选DNA结合蛋白的方法，它结合了单杂交系统和双杂交系统的特点。是专门用来鉴别那些只有在与
12、第二个已知配体以异二聚体形式复合时才结合DNA的蛋白质，或者用来鉴别那些不能自主结合DNA、但在有附属蛋白质存在时可以形成稳定的三维复合物的蛋白质。另外，还出现了一些由双杂交系统衍生而来的既能筛选蛋白蛋白相互作用又能筛选蛋白DNA相互作用的酵母单双杂交系统（one-two-hybid system）等，但应用都没有双杂交系统广泛。3 酵母三杂交系统 近几年来，以双杂交思想为基础建立起来的三杂交系统（three-binding hybid system）可用来研究多至三个分子间的相互作用。两个蛋白之间通过第三者发生相互作用，第三物可以是蛋白质、小分子、或RNA。,三杂交系统,两个蛋白之间通过第三
13、种成分，如：联结蛋白、修饰酶、RNA或小分子量的化合物构建了三杂交系统。在酵母三杂交系统的最初实验中，糖皮质激素受体与地塞米松FK506联结用于捕捉FK506结合蛋白。,反向双杂交系统,反向双杂交系统提供了简便的鉴定阻断蛋白间相互作用的方法。这项技术的关键是报道基因URA3的引入。URA3基因在这里起到了反向选择的作用，它编码尿嘧啶合成的关键酶，同时它又可催化5-氟乳清酸（5-FOA）转化为对细胞有毒的物质。Vidal等将URA3基因的启动子内引入GAL4的结合位点，从而改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。而在含有5-FOA的
14、完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。如果目的蛋白，即与BD或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用，URA3基因不能表达，则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长。因此可通过筛选5-FOA抗性克隆从随即突变库中鉴定出下调蛋白相互作用的突变体。反向双杂交系统可更有效地反应蛋白质间作用的位点或起决定作用的个别氨基酸，进而分析蛋白结构和功能的关系。,无核双杂交系统,经典的酵母双杂交系统局限性之一是不适合转膜蛋白的相互作用。现在，在基因组范围内的酵母双杂交对转膜蛋白的研究甚少，近几年来，其他几种酵母双杂交系统已经鉴定了膜蛋白和细胞质蛋白相联系的蛋白质的相互
15、作用。其中包括反向Ras补充系统，G蛋白融合方法和分离泛素膜蛋白酵母双杂交技术。,酵母双杂交技术应用的趋势及展望,酵母双杂交技术问世十多年来，已经在蛋白质间的相互作用研究、筛选新的蛋白、研究蛋白质的功能等诸多方面发挥了重要作用。据估计，目前发表的研究蛋白质相互作用的文献中超过一半的发现来源于酵母双杂交实验。该技术已经成为许多实验室研究蛋白质的相互作用和蛋白质的结构与功能的必备手段。目前，相当一部分的实验已经把重点放在如何利用双杂交系统作为媒介来研究蛋白相互作用的调控机制以及寻找蛋白质作用图谱，这在后基因组时代更具意义。,PUBMED搜索“yeast two hybrid”1989年2005年,
16、基因敲除技术,基因功能研究的主要策略,基因敲除基因陷阱T-DNA标签转座子标签反义RNA技术,基因敲除的产生背景,80年代后半期，在同源重组技术及胚胎干细胞（ESC）技术逐步完善基础发展起来的一门新兴的生物技术 技术基础 80年代初，ESC分离和体外培养的成功 理论基础 1985年Smithies首次在哺乳动物中实现了同源重组,基因敲除的应用现状,作为功能基因组学研究方法，在动物小鼠和酵母中使用较为广泛，但在植物中仅在苔藓植物中使用较为成功，虽有人在高等植物中作了大量实验，但大部分是不成功的，或至少是用常规途径是不可行的。通过对突变小鼠的表型分析，许多与人类疾病相关的新基因的功能已得到阐明，并
17、直接导致了现代生物学研究各个领域中许多突破性的进展现已逐步完善，已从简单的完全基因敲除发展到条件基因敲除，且正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控方向发展,基因敲除的基本概念,基因敲除（gene knock out），又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细胞基因组中顺序相同或非常相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其他顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动（植）物，推测相应基因的功能,基因敲除的基本方法,通过构建一个突变或缺失的同源媒介
18、基因载体，与受体细胞基因组中序列相同或相近的正常细胞因子基因进行同源重组，从而整合到受体细胞的基因组中获得同源重组的基因，并筛选出所需要的突变或缺失基因，经鉴定后将此基因用胚囊显微注射、电穿孔技术等导入ESC，寄养于假孕的动物体得到嵌合体，嵌合体再将突变或缺失的基因遗传给子代杂合子，杂合子相互交配可得到野生型、杂合子和突变纯合子，最后对纯合子的表型、基因型、基因表达及其产物等进行分析来确定基因功能,基因敲除的主要类型,条件型基因敲除 通过定位重组系统实现基因的敲除完全基因敲除 通过同源重组直接将靶基因在细胞或个体中的活性完全消除,基因敲除的基本原理,利用同源重组的原理，用突变的外源DNA片段整
19、合入受体细胞的DNA同源序列中，取代某一特定基因从而获得基因型发生改变的打靶小鼠，以研究靶基因的体内功能或相关疾病的致病机制,基因敲除的基本程序,将基因组中某一基因克隆，产生其全部或部分的DNA序列，用插入、删除、置换、修饰等手段对DNA序列重新构建，获得一个携带DNA突变序列的打靶载体（其侧翼是与基因组中靶基因同源的序列）将靶载体导入小鼠ESC中，使突变DNA与ESC基因组中相应部分发生同源重组，将靶载体DNA序列整合到内源基因组中从而得到表达从细胞水平和分子水平筛选富集发生突变的细胞，注入小鼠囊胚腔中，将囊胚导入假孕母鼠的子宫内，发育成嵌合鼠将雄性嵌合鼠与正常鼠交配，获得生殖系携带突变基因
20、的纯合鼠，分析纯合鼠的表型、基因型、基因表达及其产物,基因敲除的主要技术图,基因敲除技术的优点,整合位点确定、精确，转移基因效率高既可用正常基因敲除突变的基因，以进行性状的改良和遗传病的治疗，又可用突变的基因敲除正常的基因，以研究基因在发育和调控方面的作用遗传改变非常清晰，可研究经典遗传学无法了解的基因的表现型效应,基因敲除技术的缺点,操作复杂，实验周期长，费用居高不下由于基因不完全敲除导致泄漏突变，即在基因敲除过程中，由于被破坏的只是染色体中靶基因的某一个或几个外显子而不是该基因的整个编码区，残留的编码序列有可能获得新的未知的功能，这将给表型分析带来麻烦基因敲除过程中大规模的染色体片段删除导
21、致其它基因的编码区或者调控元件的删除，从而造成多基因删除或者死表型由于基因的冗余和代偿机制给表型分析带来很大困难同一个打靶载体由于在不同遗传背景下进行基因敲除使获得表型差异很大,大规模随机基因敲除基因捕获的产生背景,用常规方法进行基因打靶研究需耗费大量的时间和人力，研究者需针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，绘制相应的物理图谱，构建特异性的打靶载体，筛选中靶ESC等。通常一个基因敲除纯合子小鼠的获得需要一年或更长的时间。面对人类基因组计划产生出来的巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因敲除方法显得有些力不从心利用基因捕获（gene trapping)可建立一个携带随机插入突变的ES
22、C库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作和费用，更有效、更迅速地进行染色体组的功能分析,基因捕获的策略,典型的基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因，通常是neo基因，neo基因插入到ESC染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达基因的ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来 从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应100地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得不需要产生可见的突变来筛选突变子，只需报告基因的表达将转化子筛选出来，就可以通过已知序列的“标签”扩增侧翼序列。由于所使用的报告基因可用来监视动（植）物体内的基因表达模式，所以可分离细胞或组织特异性和时序特异性表达的基因,谢谢！,
