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1、食品卫生微生物学指标,食品卫生标准,是检验食品卫生状况的依据，包括,目前实际应用的指标菌可以分为以下三种：一、一般卫生状况指标菌，包括菌落总数、霉菌和酵母菌总数；二、粪便污染指标菌，包括大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌、霍乱弧菌等；三、致病菌，包括金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌等。,食品卫生标准中的微生物指标,菌落总数,菌落总数指食品检样经处理，在一定条件下培养后，所得1g食品或1mL食品中或1cm2食品表面积上所含有的细菌菌落总数。,1.1菌落总数概念和其所指示的卫生意义,一定条件：如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等不能满足厌氧或微需氧
2、菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌的生长因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类 单位菌落形成单位叫做CFU（colony forming units）,菌落总数所指示的食品卫生意义 ：,它可以作为食品被污染程度的标志，一般食品中菌落总数越多，则表明该食品污染程度越深。,它可以用来预测食品存放的期限或程度。,检测方法与步骤,平板菌落计数法基本操作一般包括： 样品的稀释倾注平皿培养48小时计数报告。,GB中国国家标准SN 中国检验检疫行业标准FDA BAM(Bacteriological analytical manual) 美国食品药品管理局细菌学分析手册
3、ISO(International Organization for Standardization )国际标准化组织AOAC国际分析化学家协会,细菌总数的常规检验方法,-样品的稀释-倾注平皿-培养48（24）小时-计数-报告,稀释平板菌落计数法(Plate Counter),操作步骤,稀释平板菌落计数法,稀释液的选择,样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1%蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。,培养温度一般为37（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30）培养时间一般为48h
4、，有些方法只要求24h的培养即可计数培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15 在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别,培养条件,平板计数琼脂培养基（PCA）,胰蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖1.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，pH7.00.2,12115分钟灭菌。,若有二个稀释度均在30300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。,计数原则,到达规定培养时间，应立即计数。如
5、果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h。,中国国家标准GB计数时应选取菌落数在30300cfu/g的平板（SN检验检疫行业标准要求为25250cfu/g）。,如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。,若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。,如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同
6、一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。,当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。,当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4
7、计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。,菌落数的报告,按国家标准方法规定菌落数在1100时，按实有数字报告。如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。,方法优点,方法简便，较精确，重复性好。,细菌总数的其它检验方法,涂布平板法点滴平板法螺旋平板法：螺旋平板法是由一台机器完成的。,涂布平板法,是将营养琼脂制成平板、经5012小时或351820小时干燥后，在上面滴加检样稀释液0.2ml，用“L”棒涂布于整个平板的表现，放置约10分钟，将平板翻转，放至36+1温箱内培养24
8、2小时，（水产品用30C培养482小时)取出，进行菌落计数，然后乘以5(由02ml换算为1ml)，再乘以样品稀释液的倍数，即得每克或每升检样所含菌落数。,涂布法优缺点,比常规检验法效果好。因为菌落生长在表面，便于识别和检查其形态，虽检样中含有食品颗粒，也不会发生混淆但是本法取样量比常规检验法少。代表性会受到一定影响。,点滴平板法,与涂布平板法相似。不同的是点滴平板法只是用标定好的微量吸管或注射器针头按滴(使每滴相当于0025m1)将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域(预先在乎板背面用标记笔划成四个区域)每个区域滴1滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行试验。滴加后，将平板放平约10分钟，然后翻转
9、平板，如涂布平板法+样移入温箱中，培养68小时后进行计数，将所得菌落数乘以40(由0025m1换算为1ml)，再乘以样品的稀释倍数，即得每克或每毫升检样所含菌落数。,螺旋平板仪,粪便污染指示菌类,理想的指示菌应具备的性能,必须与粪便或病原菌有密切关系。它们正常寄居场所应是人或动物的肠道，在正常情况下不应在一般检样中存在。,在普通培养基上易生长，用简单的操作方法即能快速和准确地测定出数量。,它们与肠道致病菌应有相同的对外界不良因素的抵抗力。,大肠菌群,粪便污染指示菌之一-大肠菌群(coliforms),一、大肠菌群(coliforms)的定义,二、大肠菌群MPN值（大肠菌群数）所指示的卫生意义,
10、三、大肠菌群计数方法：国家标准法（一）大肠菌群MPN计数法（二）大肠菌群平板菌落计数法,大肠菌群,大肠菌群(coliforms)的定义,具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢的杆菌。包括埃希氏菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等的一些菌种。,分布广泛：土壤、人和动物肠道。,大肠菌群MPN值,指每1g或1ml食品检样中大肠菌群最可能数（most probable number）。,大肠菌群MPN值（大肠菌群数）所指示的卫生意义：,1.它可作为粪便污染食品的指示菌。,2.它可作为肠道致病菌污染食品可能性的指示菌。,样品稀
11、释初发酵试验复发酵试验,大肠菌群计数方法：国家标准法,方法一-大肠菌群MPN计数法：,不产气,产气,图 大肠菌群MPN计数法检验程序,样品稀释平板计数典型和可疑菌落数证实试验,大肠菌群计数方法：国家标准法,方法二-大肠菌群平板计数法：,图 大肠菌群平板计数法检验程序,计数典型和可疑菌落,10 倍系列稀释,选择适宜3 个连续稀释度的样品匀液，接种VRBA 平板,检 样25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质,BGLB肉汤,报告结果,36 1 ,36 1 ,18 h 24h,24h 48h,VRBA结晶紫中性红胆盐琼脂培养基成分：蛋白胨7.0g；酵母膏3.0g；乳糖10.0g；氯化钠5.0
12、g；胆盐或3号胆盐1.5g；中性红0.03g；结晶紫0.002g；琼脂15-18g；蒸馏水1000mL；pH7.40.1。制法：将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2min，将培养基冷却至45-50倾注平板。使用前临时制备，不得超过3h。,选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。,大肠菌群在VRBA上的菌落特征,证实试验从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 1 培养24 h48 h，观
13、察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。,大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。,乳糖发酵试验分离培养证实试验,大肠菌群的检测：旧国家标准-三步法,产气实验,（伊红美蓝）琼脂培养基原理,琼脂培养基中含有的伊红和美蓝染料，可抑制革兰氏阳性细菌。那些能发酵乳糖的细菌，能将染料摄
14、入细胞，从而使菌落呈现出紫色或边缘无色、中央暗黑色的菌落。,培养基成分,肉汤蛋白胨培养基毫升（h.），乳糖溶液毫升，伊红溶液毫升，.美蓝溶液毫升。,配制方式,将已灭菌的肉汤蛋白胨琼脂培养基熔化以无菌操作加入预先灭菌的乳糖溶液毫升、伊红溶液毫升及.美蓝溶液毫升。,培养结果观察,大肠杆菌的菌落在透射光下呈紫黑色，在反射光下常常有一种金属光泽（亮绿色）产气杆菌以粘质状菌落丰盛地生长，呈棕色一般肠道致病菌不发酵乳糖，故呈粉红色或兰色的菌落,中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽,粪便污染指示菌之二-粪大肠菌群（faecal coliforms）或耐热大肠菌群,首先由Eijkman提出，指的是在高温下发酵
15、乳糖，是总大肠菌群的亚群，同时也称为耐热大肠菌群。大肠菌群包括：粪（便）大肠菌群和非粪（便）大肠菌群。,粪大肠菌群（faecal coliforms）或耐热大肠菌群,粪大肠菌群定义在44.5 条件下发酵乳糖产酸产气，革兰氏阴性兼性厌氧的小杆菌。包含绝大部分大肠杆菌，少数肠杆菌和克雷伯氏菌属的某些品系。 粪大肠菌群的检测，除水、贝类、贝类养殖水在44.5进行，其他所有食品都在45.5进行。,粪便污染指示菌之三-大肠杆菌,是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群条件致病菌,大肠杆菌，学名为大肠埃希氏菌（ Escherichia coli，E.coli ）,大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸
16、产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为+-或-+-的细菌。与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。,大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测,大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测,菌落总数和大肠菌群MPN的其他测定方法,疏水网膜法（膜过滤法）TTC（2、3、5、氯化三苯四氮唑）显色法DC(去氧胆酸钠)半固体法纸片法等,膜过滤法,最适合于检测水样品，也可用于含微量颗粒少的液体食品。,我国饮用水卫生标准：, 3个大肠菌群/1L饮
17、水 100个细菌总数/1ml饮水,水中大肠杆菌的检测方法主要有多管发酵法和滤膜法等。其中，多管发酵法是根据大肠杆菌能发酵乳糖并产酸产气，以及革兰氏阴性、无芽孢、在伊红美蓝培养基上菌落呈深紫黑色并具有金属光泽等特性，通过初发酵实验、平板分离和复发酵实验三个步骤进行检测，以求得水样中的大肠杆菌数。用该法检测大肠杆菌虽费时较久、手续较繁，但准确可靠，是经典的检测方法。,膜过滤,TTC（2、3、5、氯化三苯四氮唑）显色法,在计数琼脂中加入适量的TTC(0.5% TTC 1ML加到100ML琼脂中),细菌菌落长成红颜色,对去除食品本底颗粒物干扰非常有意义.,酵母菌在TTC上的菌落特征,DC(去氧胆酸钠)
18、半固体法,（1）选择三个稀释度的样品液，每个稀释度分别取1ml放入灭菌试管中。 (2)将溶化并冷至50左右的DC半固体培养基加入上述试管中，每管3m1。立即混合)，凝固后于37培养1824小时。(3)判定标准和记录：a培养基变桔红色，有气泡产生或琼脂崩裂。记录为；b培养基为桔红色，或有桔红色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象，记录为十；c培养基为绿色，有黄色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象，记录为；d培养基为绿色，记录为。(4)判定为a、d反应结果；记录阳性管数，查MPN表并报告之。若为b、c反应结果，可挑大肠菌群可疑菌落接种乳糖复发酵管，根据产酸产气管数查MPN表，并报告之。,菌落为红色，周围有红色的菌落
19、胆盐沉淀环，直径为2-3mm或更大,粪便污染指示菌之四-肠球菌（Enterococcus）,是链球菌属中的一个血清学群（D型群）（Lancefield应用链球菌细胞壁中多糖类半抗原，将链球菌分成ABCD-十九个血清群）,肠球菌分类,1989年，依据Facklam和Collins的分类，肠球菌属内包括十二个种及一个变异株，它们是：粪肠球菌（E.faecalis） 屎肠球菌（E.faecium) 鸟肠球菌(E.avium) 酪黄肠球菌(E.casseliflavus) 坚忍肠球菌(E.durans) 鸡肠球菌E.galinarum) 芒地肠球菌(E.mundii) 恶臭肠球菌(E.maladora
20、tum) 希拉肠球菌(E.hirae) 孤立肠球菌（E.solitarius） 棉子糖肠球菌(E.raffinosus) 假鸟肠球菌(E.pseudoavium) 粪肠球变异株(E.faecalis var)。粪肠球菌为该属中最常见的即为代表种。,自然界分布广，存活力持久肠球菌普遍存在于自然界，一般栖居在各种温血和冷血动物的腔肠，甚至昆虫体内，也是健康人体的上呼吸道，口腔或肠道的常居菌。本菌可以引起心内膜炎，胆囊炎，脑膜炎，尿路感染及伤口感染等多种疾病。在人类粪便中的数量仅次于大肠菌群，每克成人的粪便中约含108个。,肠球菌分布,肠球菌生物学性状,肠球菌属的细菌为革兰氏阳性球菌，多数菌种成双或
21、呈短链状排列；一般无芽胞，无荚膜，少数菌种有鞭毛，陈旧培养物或在厌氧状态下有时呈革兰氏阴性。 最适生长温度37，最适pH为4.7-7.6，属内各菌种均能在.5%氯化钠肉汤,pH9.6葡萄糖肉汤及生长，个别菌种在50时生长快。,抵抗力强及耐受性强 ，生长营养要求不高 目前该菌多作为生活饮用水，管道水和一些水质的指示菌。卫生学家认为，肠球菌类似于大肠菌群的生态活动，但其对恶劣的外环境和冷冻条件具有较强的抵抗力，作为监测水质卫生，环境卫生质量的污染指标更具有卫生学意义。,肠球菌抵抗性,致病菌,三、致病菌（病原菌）,根据不同食品的特点选定一定的病原菌作为检验的重点对象。例如蛋粉、冷冻禽类、肉类食品等常
22、规定沙门氏菌是必须检验的重要项目；酸度不高的罐藏食品，肉毒杆菌是必须检验的对象；酸牛奶则规定肠道致病菌和致病性球菌（链球菌和葡萄球菌）是检测重点。,食品中常见的致病性微生物,能引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物：沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等,能产生毒素并引起食物中毒的微生物：肉毒梭菌、葡萄球菌和产气荚膜杆菌，也包括一些真菌，都会产生毒素。,致病性大肠杆菌,病原性大肠杆菌（致病性大肠杆菌）分类：,肠产毒性大肠杆菌（enterotoxigenic E. coli , ETEC）,肠致病性大肠杆菌（enteropathic E. coli , ETEC）,肠侵袭性大肠杆菌
23、（entero invasive E. coli , ETEC）,肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic E. coli , ETEC）,大肠杆菌0 157：H7血清型属肠出血性大肠杆菌,大肠杆菌O157,生物学特性,革兰氏阴性短杆菌，大小0.513微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），,4、抗原构造复杂,鞭毛抗原（H）,菌体抗原（O）,K或Vi抗原,致病物质,大肠杆菌的致病物质为定居因子，即大肠杆菌的菌毛肠毒素,所致疾病,肠道外感染 急性腹泻,月桂基硫酸盐胰蛋白胨 （LST）肉汤,
24、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤是 GB 标准、 SN 标准、 APHA 和 ISO 推荐的培养基，用于食品和水中大肠菌群的选择性增菌和近似计数。 配方 (g/L) :胰蛋白胨 20.0; 氯化钠 5.0; 乳糖 5.0; 磷酸氢二钾 (K2HPO4) 2.75 ;磷酸二氢钾 (KH2PO4) 2.75; 月桂基硫酸钠 0.1;pH 6.8 0.2。此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。,煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤,蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g胆盐或3号胆盐 1.5g煌绿水溶液 13.3ml蒸馏水 1000.0mL,EC 肉汤,是由 Hajna and Perry 改进， GB 标准 和 SN 标准推荐的培养基，用于食品、水和其它样品中大肠杆菌 ( 44.5 ) 和大肠菌群 ( 37 ) 增菌和检测。 成方 (g/L) ：胰蛋白胨 20.0 ，乳糖 5.0 ，3 号胆盐 1.5 ，磷酸氢二钾 (K2HPO4) 4.0 ，磷酸二氢钾 (KH2PO4) 1.5 ，氯化钠 5.0 ，pH 6.9 0.1 25 。此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。,大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠（月桂基硫酸钠）、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。,
