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1、,Jason WangTechnical Account Manager,Qualicon China,2,EHEC O104:H4,3,肠杆菌科(Enterobacteriaceae),一大群居住在人和动物肠道中生物学性状近似的革兰阴性短小杆菌,广布于自然界,多数是肠道的正常菌群，但当宿主免疫力降低或细菌移位至肠道外部位时可成为条件致病菌,至少有30个菌属，120个以上的菌种,少数为致病菌，是肠道传染病的最重要病原菌,4,肠杆菌科中与医学有关的常见菌属,埃希菌属 大肠杆菌 志贺菌属 痢疾志贺菌 爱德华菌属 迟钝爱德华菌 沙门菌属 伤寒沙门菌 枸橼酸菌属 弗氏枸橼酸杆菌 克雷伯菌属 肺炎克雷伯
2、菌 肠杆菌属 产气肠杆菌 哈夫尼亚菌属 蜂窝哈夫尼亚菌 沙雷菌属 粘质沙雷菌 变形杆菌属 普通变形杆菌 摩根菌属 摩氏摩根菌 普罗威登斯菌属 雷氏普罗威登斯菌 耶尔森菌属 鼠疫耶尔森菌 欧文菌属 草原居民欧文菌,菌属 代表种,5,H抗原(鞭毛),O抗原(LPS侧链),K抗原或Vi(荚膜),F抗原(菌毛),复杂的抗原构造,6,肠杆菌科的细菌引起不同部位感染,中枢神经系统（埃希菌属）,下呼吸道（克雷伯菌属、肠杆菌属、埃希菌属）,血液（埃希菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属）,胃肠道（埃希菌属、沙门菌属、志贺菌属、耶尔森菌属）,泌尿道（埃希菌属、变形杆菌属、克雷伯菌属、摩根菌属）,7,埃希氏菌属 Esche
3、richia,是人类和动物肠道中的正常菌群,出生后数小时就进入肠道，并终生伴随,以大肠埃希菌（E.coli）最为重要，是最常见的临床分离株,大肠埃希菌,8,正常菌群，一般不致病,条件致病,某些带有致病基因的血清型，引起肠道感染,细菌居住部位改变引起的肠外感染：,尿路感染最常见,致病菌株,大肠埃希菌,9,分类,可引起腹泻的大肠杆菌称为肠道致病性大肠杆菌或致泻性大肠杆菌。目前根据毒力因子、致病机理和流行病学特征，通常将致泻性大肠杆菌分为5 类：肠产毒性大肠杆菌（ETEC）肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）肠致病性大肠杆菌（EPEC）肠黏附性大肠杆菌（EAEC）肠出血性大肠杆菌（EHEC）,10,致泻性大
4、肠杆菌引起的腹泻,11,肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC）,代表菌株：E2348/69，血清型O127:H6测序菌株：E2348/69 EPEC是流行病学研究中最早发现的引起腹泻的大肠杆菌，不产生肠毒素及其他外毒素，无侵袭力。病原菌在十二指肠、空肠和回肠上段粘膜表面大量繁殖，粘附于微绒毛，导致刷状缘被破坏、微绒毛萎缩、上皮细胞排列紊乱和功能受损，造成严重腹泻。EPEC对细胞的粘附有两种类型。局限性粘附是指病原菌呈块状粘附在肠粘膜细胞表面的某一部分，弥散性粘附是病原菌主要以单个分散粘附在细胞表面。由于两者在生物学特性、致病性等方面存在
5、较大差异，有学者称弥散粘附的EPEC为EPEC 型或者弥散粘附性大肠杆菌（Diffusely Adherent Escherichia coli,DAEC）。,12,肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC）,13,肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC）,典型EPEC（typical EPEC，含有LEE和70100kb的大毒力质粒EAF）是发展中国家引起婴幼儿特别是06个月婴儿腹泻的主要病原菌，在某些发展中国家EPEC引起的婴儿腹泻可达3040%，甚至超过轮状病毒所占的比例。上世纪
6、4050年代之前，EPEC常引起发达国家婴幼儿腹泻的暴发，但目前典型EPEC在发达国家却很少见。而非典型EPEC（atypical EPEC，含有LEE但不含毒力质粒EAF）是发达国家引起腹泻的重要病原菌，并能引起发达国家婴幼儿和成人的腹泻暴发。非典型EPEC感染引起的腹泻通常持续时间更长，可超过14天。典型EPEC的储存宿主主要是人，而非典型EPEC人和动物都可作为储存宿主。,14,肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）,代表菌株：10407测序菌株：E24377A ETEC是5岁以下婴幼儿和旅游者腹泻的重要病原菌。ETEC的致病物质主
7、要是肠毒素和定植因子。肠毒素有不耐热肠毒素（heat labile enterotoxin,LT）和耐热肠毒素（heat stable enterotoxin,ST）两种。LT与腺苷环化酶作用，使胞内cAMP水平增高，导致肠粘膜细胞内水、钠、氯等过度分泌至肠腔，导致腹泻；而ST通过激活肠粘膜细胞上的鸟苷环化酶，使胞内cGMP升高而导致腹泻。,15,肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）,菌毛粘附素（adhesin）是ETEC致病的另一重要因素。能形成肠毒素而无菌毛的菌株，不会引起腹泻。菌毛粘附素常被称之为定植因子（colonization
8、 factor，CF）。与ETEC致病有关的定植因子主要包括K88、K99、987P、F41、CFA/I（colonization factor antigen type I）和CFA/II等；其中CFA/I和CFA/II只在人源性ETEC中发现；ETEC菌毛的粘附作用具有高度专一性，如CFA其作用不被甘露糖所抑制，与大肠埃希菌型菌毛的受体完全不同。大肠埃希菌第一个被认识的定植因子是猪大肠埃希菌的表面抗原K88，菌毛性质，由转移性质粒控制。定植因子具有很强的抗原性，能刺激宿主产生特异性抗体。在兽医界已制成口饲菌毛疫苗，在猪群中人工免疫后，可抵抗猪ETEC的侵袭。,16,肠集聚性大肠杆菌（Ent
9、eroaggregative Escherichia coli,EAEC）,代表菌株：Ec042，血清型O44:H18测序菌株：55989 EAEC不侵袭细胞，可产生毒素和粘附素。毒素包括肠集聚耐热毒素（enteroaggregative heat-stable toxin,EAST）和不耐热毒素（plasmid encoding toxin，Pet）。EAST抗原上与ETEC的ST有关，可导致大量液体分泌。另一毒素似大肠杆菌的溶血素。EAEC有4种不同形态的菌毛，其中集聚性粘附菌毛I（aggregative adherence fimbriae I，AAF/I）与EPEC中bfp基因编码的菌
10、毛很相似。细菌通过菌毛粘附于肠粘膜上皮细胞，在细胞表面聚集，形成砖状排列。,17,肠集聚性大肠杆菌（Enteroaggregative Escherichia coli,EAEC）,Localized adherence,Aggregative adherence,Diffuse adherence,18,肠集聚性大肠杆菌（Enteroaggregative Escherichia coli,EAEC）,肠集聚性大肠杆菌可引起人类特别是小儿急性或顽固性腹泻，EAEC感染的典型症状包括水样，粘液样，分泌性腹泻，通常无呕吐或很少出现呕吐，不伴有发热或仅有低热。部分病人粪便中可以检测到血细胞。肠集聚
11、性大肠杆菌感染是发展中国家腹泻的重要病因。巴西的研究数据表明，EAEC感染是小儿腹泻最常见的病因。在美国，EAEC是继ETEC之后导致成人旅游者腹泻的第二大病原菌，同时EAEC也是导致美国儿童腹泻最常见的病原菌。EAEC除引起散发感染外，在日本、意大利、英国、墨西哥、塞尔维亚等国均有EAEC引起暴发的报道。,19,肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive Escherichia coli,EIEC）,代表菌株：44825测序菌株：53638（尚未测完）EIEC较少见，主要侵犯较大儿童和成人。所致疾病很像细菌性痢疾，腹泻呈脓血便，有里急后重。EIEC不产生肠毒素，能侵袭结肠粘膜上皮细胞并在
12、其中生长繁殖。细菌经消化道进入大肠后，穿过粘液层，粘附到肠上皮细胞上，引起细胞内吞，被带入细胞内空泡中。其毒力主要表现在能使空泡破坏，细菌进入上皮细胞胞浆中增殖，最后杀死细胞，再扩散到邻近细胞，导致组织破坏和随后的炎症发生。EIEC的侵袭与一种大质粒（120MD140MD）有关，该质粒与编码志贺菌侵袭力的大质粒高度同源，分子量也相近，丢失了质粒的菌株毒力也随之丧失，成为无毒株。,20,肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC）,代表菌株：EDL933、Sakai，血清型O157:H7测序菌株：EDL933、Sakai等 1982年在美国的
13、俄勒冈州和密执安州的一起出血性肠炎暴发中首次分离到大肠杆菌O157:H7，并被确认为病原菌。大肠杆菌O157:H7是EHEC中最主要的血清型，EHEC也包括其它如O111:H8、O26:H11、O103:H2等血清型的部分菌株。大肠杆菌O157:H7感染可引起轻度腹泻、出血性结肠炎（HC）、溶血性尿毒综合症（HUS），血栓性血小板减少性紫癜（TTP）等。其中HUS病程凶险，易造成急性肾衰竭乃至死亡。,21,肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC）,EHEC的致病因子主要有菌毛和毒素。病菌进入消化道后，由紧密粘附素介导与宿主末端回肠、盲肠
14、和结肠上皮细胞结合，然后释放毒素，引起血性腹泻。EHEC产生的毒素能使vero细胞（非洲绿猴肾细胞系）产生病变，故称vero毒素；又因同志贺菌的毒素在生物学特性、物理特性和抗原性等方面相似，亦称志贺样毒素（shiga-like toxin，SLT）或志贺毒素Stx；EHEC的Stx分两型，Stx1与痢疾志贺菌的ST基本相同，可被抗志贺菌抗毒素中和。Stx2则与ST有60%的同源。两型毒素均由溶原性噬菌体介导。eaeA基因编码紧密粘附素，它与EPEC的eaeA高度相似。pO157质粒编码的肠溶血素。,22,肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli,E
15、HEC）,自1982年美国首次报道因该菌引起的食物中毒以来，大肠杆菌O157:H7疫情报道日渐增多，相继在英国、加拿大等多个国家发生暴发流行。1996年日本报告病例逾万例，死亡9例。1999年我国部分地区发生了大肠杆菌O157:H7感染性腹泻的暴发，我国遭受肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻威胁的形势亦很严峻。最近一次较大的暴发流行发生在2006年美国。此次暴发的由受到污染的包装菠菜造成的食源性传播，波及5个州，报告病人71例。,23,肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC）,二十世纪90年代后，报告发生大肠杆菌O157:H7暴发
16、和散发病例的国家和地区不断增多，而既往已发生过O157:H7感染发生的国家和地区病例数量也在不断上升，且逐年呈上升趋势。O157:H7大肠杆菌感染已成为一个全球性的公共卫生问题，无论在发达国家还是发展中国家，都受到广泛关注。,24,肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC）,STEC，Shiga toxin producing E.coli 人们把产生VT毒素的大肠杆菌统称为STEC。相对来说，STEC的范围大一些,EHEC覆盖的范围小一些。STEC包括EHEC,EHEC只是STEC的一部分。并不是所有的产Stx毒素的大肠杆菌都能引起出血
17、性肠炎或溶血性尿毒综合症。,25,EHEC O104:H4,26,EHEC O104:H4检测程序,根据标本的种类，按照公布标准的方法，进行标本的预处理。使用EHEC增菌液增菌6小时。对增菌液提取核酸，进行PCR检测，包括毒力基因（stx1、stx2）。或可使用DuPont PCR Reagent Kit(D14128299)直接加入增菌液进行荧光定量PCR检测。对PCR检测stx1,stx2 基因阳性的标本，进行eae、ehx、aatA、aggR、aap毒力基因和O104和H4的抗原特异性基因检测。同时进行大肠杆菌的分离培养鉴定，对单个菌落进行生化、血清型鉴定。,27,EHEC O104:H
18、4检测程序,28,EHEC O104:H4毒力基因检测,1、stx1slt-1-aCAGTTAATGTGGTGGCGAAGG 348bpslt-1-bCACCAGACAATGTAACCGCTG针对Shiga toxin 1 subunit A2、stx2slt-2-aATCCTATTCCCGGGAGTTTACG589bpslt-2-bGCGTCATCGTATACACAGGAGC针对Shiga toxin 2 subunit A,29,EHEC O104:H4毒力基因检测,3、eaeAeaeA-aATTACCATCCACACAGACGGT 397bpeaeA-bACAGCGTGGTTGGATCA
19、ACCT4、ehxAMFS-1F ACGATGTGGTTTATTCTGGA 167bp/369bpMFS-1R CTTCACGTCACCATACATATMFS-1Fb CCAGGAGAAGAAGTTAGAG,30,EHEC O104:H4毒力基因检测,5、aatA aatA-F:5-tgaaatgcttagtgagag-3 510bp aatA-R:5-gatacccagactagcact-36、aggR aggR-F：5-GTATGAAATTAAAACAA ACATCG-3 800bp aggR-R:5-GTTTATTGGCTTTTAAAATAG TC-3 7、aap aap-F：5-ATG
20、AAAAAAATTAA GTTTGTTATCTT-3 356bp aap-R：5-TTATTTAACCCATTCG GTTAGAGC-3,31,EHEC O104:H4毒力基因检测,O104检测PCR引物,32,EHEC O104:H4毒力基因检测,H4检测PCR引物,H4特异引物：fliC-5(5-TGA GTG ACC AGA CGA TAA CAG GG-3)fliC-6(5-GGA CGA TTA GTG GGT GAA ATG AGG-3)PCR产物大小1243bp.,33,EHEC O104:H4毒力基因检测（杜邦试剂盒）,荧光定量PCR反应体系：,将Forward Primer和Reverse Primer混合后用试剂盒提供的PCR buffer稀释至终浓度，取25ul取PCR buffer裂解后的增菌液25uL总反应体系50uL，直接加入带有PCR药片的反应管中。,34,
