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1、血细胞P53基因表达检测 RT-PCR 湘雅医检1501,P53基因,P53基因,命名,该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质,功能作用,重要的抑癌基因，防止癌变细胞基因的修复功能,RT-PCR,RT-PCR(反转录PCR技术),RNA的反转录（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。,在GenBank中查找p53基因,设计引物确定参数,检测p53基因在血细胞中的表达,反转录的引物,五个主要问题,基因表达的检测方法,基因表达的检测方法,Ques,在蛋白质水平,基因检测的方法,在DNA水平,在mrna水平,Northern印记杂交RT-P
2、CR.,Reverse Transcription PCR,RNA提取,cDNA,反转录,PCR,Northern 印记杂交,Northern印记杂交,基因表达水平,随机六核苷酸引物引导Oligo(dT)引导特异性引导,反转录,Ques,反转录酶,逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补 的双链cDNA.,反转录
3、可用的引物,01,03,05,Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。,随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。,特异性引物：用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。,GENBANK中查找P53基因,Ques,查找P53序列,使用genbank，p53登陆号AH007667,http:/www.ncbi.
4、nlm.nih.gov/genbank,查找P53序列,查找P53序列,查找P53序列,引物设计的原则,1,5,2,6,3,7,4,8,引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性,产物不能形成二级结构,引物长度一般在1530碱基之间,G+C含量在40%60%之间,碱基要随机分布,引物自身及之间不能有连续4个碱基的互补,引物5端可以修饰引物3端不可修饰,引物3端要避开密码子的第3位,设计引物确定参数,Ques,引物设计,Primer premier 5.0,PrimerPremier5.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列
5、编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（PrimerDesign），酶切分析窗口（RestrictionSites）和纹基分析窗口（Motif），这里我们主要介绍其引物设计功能。,引物设计1,启动界面,引物设计2,在此输入需扩增的DNA序列,引物设计3,引物设计4,引物设计5,引物设计6,引物设计7,引物设计8,Hairpin：发夹结构Dimer：二聚体False Priming：错配Cross Dimer：交叉二聚体,引物设计9,引物设计10,引物设计11,保存,选择满意的引物,引物设计12,所选引物,确定参数,cDNA size:434bp,94度 30秒,变性,55度 45秒,退火,
6、73度 60秒,延伸,27次,循环,确定参数,四项参数,循环次数,退火,延伸,变性,模板DNA由双链变成单链，有利于与引物结合。可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间，一般情况下94C 30秒可使各种复杂的DNA分子完全变性。,变性的DNA快速冷却至4060C可使引物和模板DNA发生结合。可根据引物的长度和GC的含量选择复性温度,一般是7075C，此时Taq DNA聚合酶活性最高。1kb的可适当延长时间。,理论上2025个循环PCR产物的累计即可达到最大值、实际操作中2530较合理。,确定参数,退火温度：5054,检测p53基因的表达,Ques,检测基因的表达,根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶，取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳4560min。成像系统成像分析。,琼脂糖凝胶电泳分离产物：,检测基因的表达,1 2 3 4,Marker（DNA分子量标准）,cDNA,假阳性对照（出现的PCR扩增条带一致，有时更整齐更明亮）,假阴性对照（什么条带没有）,谢谢,汇报人：李尽美,日期：2016-11-21,
