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1、PCR引物设计及相关软件使用,主要内容,背景PCR引物设计原则常用PCR引物设计软件Primer Premier 5.0 介绍Oligo 6.22 介绍在线Primer3 介绍,PCR,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。,PCR引物设计,引物设计是PCR 技术中至关
2、重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。,引物设计的原则,引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。,如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(intern
3、al stability, 用G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。,具体因素,一般原则,引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不应大于38。引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(
4、3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点,Tm值的计算一般的公式Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 对于长一些的引物可用更为准确的nearest-neighbor （Frier et al. (1986) ）,一般原则,2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。,一般原则,3，引物3端的末位碱基对Taq 酶的DN
5、A 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。,一般原则,4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推荐45-55%或50-60%,一般原则,5. G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G 值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G 值相对较高的
6、引物。引物的3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合）,一般原则,6. 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。,一般原则,7. 引物二级结构对PCR反应的影响。尽可能少的引物二聚体。,常用的引物设计软件,Oligo 6 （引物评价）*Primer Premier （自动搜索）*Vector NTI SuitDnasisOmigaDnastarPrimer3 （在线服务）*,Primer Premier 5.0 的使用技巧简介,主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA 基
7、元(motif)查找4、同源性分析,简并引物设计,根据氨基酸序列来设计引物DNA引物Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）3、支原体（Mycoplasma）4、植物线粒体（Plant Mitochondrion）5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）6、一般标准（Standard）7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion
8、）,Primer Premier 5.0使用介绍(1),Preimer Premier 启动界面,Load sequence,基本信息,Sequence name,Original sequence,Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好,Choose a function,引物设计界面,First you can design the primer manually,Sense strand or anti-sense strand
9、,Useful information of the primer,引物搜索选项设定,引物类型,搜索模式,5引物位置范围,3引物位置范围,产物大小范围,引物长度,搜索结果,28对引物,引物分值100分为满分,每对引物的信息,双击选中一对引物,引物信息,回到主窗口,引物及产物信息,是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer,一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But ,引物编辑,引物编辑,Edit primer here,Analysis the edit result,Accept the edit r
10、esult Return to the main window,Some other useful function of PP5,Enzyme,Melting temperature graph,Per 25-mer,GC% graph,Per 25-mer,Stability,Per 5-mer,Oligo 6.44 使用说明,主要功能：专门的引物设计软件,Oligo 6.44 启动界面,Open sequence file,3个弹出窗口,Melting temperature,G Internal Stability,Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率
11、。该频率高则可增加错误引发的可能性。,用Oligo 设计引物时的3个标准,Tm 值曲线以选取5到3的下降形状有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线宜选用3端Frq 值相对较低的片段。G 值在5端和中间值比较高，而在3端相对低,选中引物,上游引物,下游引物,只是示意图,引物分析,首先检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。,引物分析,二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。,引物分析,第三项检查为GC 含量，以45-55为宜。第四False priming 检查,引物分析,Key information of primer,Hairpin,Dimer and
12、 cross Dimer,GC%,Total PCR information,Final PCR information,Search for primer using Oligo 6.44,Search primer,Online primer3 service,http:/frodo.wi.mit.edu/,PCR引物设计及相关软件使用,主要内容,PCR介绍引物设计原理引物设计的优化原则Primer Premier 5.0 介绍举例说明引物的设计,PCR介绍,1、什么是PCR2、PCR的组成3、如何提高PCR成功率 （定量，对照）,引物设计原理,引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段
13、，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选 。,引物设计的原则,1、引物长度 大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(1618)的引物；若产物长5 kb，则用24个核苷酸的引 物。有人用2023个核苷酸引物得到40 kb的产物。,引物设计的原则,2、引物GC含量 GC含量在40%60%之间，以45-55为宜。这可为有效退火提供足够热。,引物设计的原则,3、引物Tm 引物所对应模板序列的Tm 值最好72左右。至少要在5580之间。 Tm=2(A+T)+4(C+G),引物设计的原则,4、引物3
14、端引物3末端和模板的碱基完全配对 防止一对引物内的同源性 考虑末端5个碱基的G 引物3端要避开密码子的第3位,引物设计的原则,5、引物序列与模板序列组成的相似性 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高 。,引物设计的原则,6、最好在模板cDNA的保守区内设计 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。,引物设计的原则,7、引物自身及引物之间不应存在互补序 列 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发
15、夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。,引物设计的原则,8、碱基要随机分布 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。,引物设计的原则,9、引物应具有特异性 引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。,引物设计的原则,10、G值 G值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应
16、而可防止错误引发。,引物设计的原则,11、引物的5端 引物的5端可以修饰，而3端不可修饰，引物5 端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。,引物设计的原则,12、在DNA测序和PCR中最好用5末端稳定(如GC含量较多)，而3末端不太稳定(如AT含量较多)的引物,Primer Premier 5.0 简介,主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分析,Primer Premier 5.0使用介绍,Preimer Premier 启动界面,Load seq
17、uence,基本信息,Sequence name,Original sequence,Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好,Choose a function,引物设计界面,First you can design the primer manually,Sense strand or anti-sense strand,Useful information of the primer,引物搜索选项设定,引物类型,搜索模式,5引物位
18、置范围,3引物位置范围,产物大小范围,引物长度,搜索结果,28对引物,引物分值100分为满分,每对引物的信息,双击选中一对引物,引物信息,回到主窗口,引物及产物信息,是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer,一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But ,引物编辑,引物编辑,Edit primer here,Analysis the edit result,Accept the edit result Return to the main window,任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1,举例说
19、明,SP,BamHI,pcDNA3.1,NR1,Plasmid 1:,Plasmid 2,GFP,SP,BamHI(GGATCC),pcDNA3.1,NR1-1a,GFP,121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301
20、 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctc
21、ct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggt
22、gctg cagtttgacc caggaaccaa,NR1的编码序列(4000bp),红色为信号肽, 蓝色为BamHI酶切位点, 下划线标出酶切位点的阅读框,ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTAC
23、G GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC A
24、GAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAA,GFP序列(700bp),引物要求,PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅
25、读框不改变,5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGAGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5,GFP序列,5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3,3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5,Primer1: 5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC,.AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5 Primer
26、2,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.,Primer2: 5 TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.,Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,第一步：扩增GFP基本序列,变性, 引物复性,第二步：GC比值；Tm值,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA.Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：
27、64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）,第三步：酶切位点,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）,BamHI: ggatcc,Primer1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,第四步：阅读框,atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctc
28、cttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct.,Primer1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA,NR1序列：,Primer1: 5 ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGA
29、GGA,atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct,NR1序列：,5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
30、C TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3,GFP序列,cgc gcg gat ccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG ?ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct,插入GFP后的组合序列,Primer2: 5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,Primer2: 5 gg atc cct CTTGTACAGCTCGTCCATGCC,第五步 保护序列,Primer1: 5 GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2: 5 GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,
