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1、1,核酸分子杂交技术Nucleic acid Hybridization,1核酸分子杂交技术Nucleic acid Hybridi,2,主要内容,第一节 核酸探针第二节 核酸分子杂交的类型第三节 杂交的影响因素,2主要内容第一节 核酸探针,3,回顾：核酸杂交的基本原理,一、核酸的结构二、核酸变性与复性三、核酸分子杂交的基本原理,3回顾：核酸杂交的基本原理一、核酸的结构,4,一、核酸的结构,一级结构：核苷酸的排列顺序稳定键：磷酸二酯键二级结构：双螺旋结构稳定键：氢键、碱基堆积力高级结构：染色体,4一、核酸的结构一级结构：核苷酸的排列顺序,5,C,G,A,一级结构 二级结构 高级结构,5CGA一
2、级结构 二级结构 高级结构,6,二、核酸变性与复性,变性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键断裂，DNA的双螺旋解开变成单链，形成无规则线团。,6二、核酸变性与复性 变性（denaturation）:,7,加热极端的pH有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）,DNA的变性因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件,二、核酸变性与复性,7DNA的变性因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性,8,变性DNA的性质：变性能导致DNA 的一些理化性质及生物学性质发生改变,二、核酸变性与复性,溶液粘度降低DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性
3、后代之以“柔软” 无规则单股线性结构，DNA粘度明显下降溶液旋光性发生改变变性后DNA分子的对称性及局部构型改变紫外吸收增加DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收增强双链DNA单链DNA单核苷酸,8变性DNA的性质：变性能导致DNA 的一些理化性质及生物学,9,二、核酸变性与复性,增色效应与温度有十分密切的关系，这主要是变性温度取决于DNA自身的性质。,融解温度（ melting temperature，Tm）：在热变性过程中，DNA的变性会在一个狭窄的温度范围内发生，当紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度,9二、核酸变性与复性增色效应与温度有十分密切的关系，这主要
4、是,10,Tm的影响因素： 1 DNA分子大小和碱基 的组成 2溶液的离子强度 3 pH值 4变性剂,DNA复杂度对Tm的影响,二、核酸变性与复性,10DNA复杂度对Tm的影响 二、核酸变性与复性,11,DNA的（G+C）含量,在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于DNA分子中的（G+C）的含量（G+C）含量越高，G-C 碱基对越多，Tm 值越高。因G-C碱基对具有3对氢键，而A-T碱基对只有2对氢键，DNA中（G+C）含量高显然更能增强结构的稳定性，破坏 G-C间氢键需比A-T 氢键付出更多的能量。,二、核酸变性与复性,11 DNA的（G+C）含量在溶剂固定的前提下，Tm值的高,12,杂交双
5、链（hybrid duplex）DNA-DNADNA-RNARNA-RNA,二、核酸变性与复性,复性（renaturation）：指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程,12杂交双链（hybrid duplex）二、核酸变性与复性,13,三、核酸分子杂交基本原理,核酸杂交示意图,分子杂交（molecular hybridization）:单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。 可以是两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链,13三、核酸分子杂交基本原理核
6、酸杂交示意图 分子杂交（mol,14,杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现复性分子杂交技术：利用探针（probe）与靶DNA（RNA）杂交，特异性识别靶DNA（RNA）,三、核酸分子杂交基本原理,14杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现复性三、,15,第一节 核酸探针,一、核酸探针的种类二、核酸探针的长度三、核酸探针的标记四、核酸探针的检测,15第一节 核酸探针一、核酸探针的种类,16,第一节 核酸探针一、核酸探针的种类,核酸探针（nucleic acid probe)：是特定核苷酸序列（单链，被标记）与靶序列发生特异性互补（可杂交）杂交后可用特殊方法检测的已知被标记的核酸分子
7、,16第一节 核酸探针一、核酸探针的种类核酸探针（nu,17,高度特异性探针的来源是否方便制备探针的难易程度,第一节 核酸探针一、核酸探针的种类,确定特定核苷酸序列（与靶序列互补）标记（检测方法）选择探针的最基本的要求,17高度特异性第一节 核酸探针一、核酸探针的种类确定,18,第一节 核酸探针一、核酸探针的种类,DNA探针cDNA探针DNA探针RNA探针寡核苷酸探针,18第一节 核酸探针一、核酸探针的种类DNA探针,19,来源：这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的全部或部分序列 制备方法:基因克隆的方法聚合酶链反应(PCR) 特点:克隆在载体中的DNA片段，可无限繁殖，制备简便相对
8、RNA而言，DNA探针不易降解标记方法也较成熟,第一节 核酸探针一、核酸探针的种类-DNA探针,19来源：这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的全部,20,cDNA（complementary DNA）：是指与mRNA互补的DNA分子特点:不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究 排除了RNA酶的影响，现已成为分子生物学实验室的常规实验,第一节 核酸探针一、核酸探针的种类-cDNA探针,20cDNA（complementary DNA）：是指与m,21,RNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高RNA分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链的竞争
9、结合RNA分子中不存在高度重复序列，非特异性杂交少，杂交后未杂交的探针分子水解可用RNA酶去除，本底的干扰低。RNA探针有易降解和标记方法复杂等缺点，限制了其广泛应用。,第一节 核酸探针一、核酸探针的种类-RNA探针,21RNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高第一节,22,特点 :探针长度较短（一般为1750bp） 人工合成（避免天然探针的缺点） 尤其适合点突变的检测 由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱 ，但经过精心设计仍可设计出非常 特异的寡核苷酸探针,第一节 核酸探针一、核酸探针的种类-寡核苷酸探针,22 特点 :第一节 核酸探针一、核酸探针的种类-寡,23,DNA，RNA
10、探针DNA探针：400-500baseRNA探针：不易控制，重组DNA分子线性化的限制性核酸内切酶的位点寡核苷酸探针探针长度：一般要求在1750bp,第一节 核酸探针二、核酸探针的长度,23DNA，RNA探针第一节 核酸探针二、核酸探针的,24,理想的探针标记物应具有以下特点特异：靶序列特异稳定：标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值灵敏：标记物被检测无毒：标记物对环境污染小，对人体无损伤简便：操作简单便易：价格低廉,第一节 核酸探针三、核酸探针的标记,24理想的探针标记物应具有以下特点第一节 核酸探针三,25,常用的探针标记物：放射性同位素标记：32P非放射性
11、同位素标记：生物素，地高辛，荧光素,第一节 核酸探针三、核酸探针的标记,25常用的探针标记物：第一节 核酸探针三、核酸探针的,26,1随机引物法 （单链） 2.缺口平移法（双链）,第一节 核酸探针三、核酸探针的标记,261随机引物法 （单链） 2.缺口平移法（双链）第一节,27,65末端标记,第一节 核酸探针三、核酸探针的标记,53末端标记,4化学法全程标记,3全程RNA探针标记,生物素-亲和素地高辛-抗地高辛抗体,2765末端标记 第一节 核酸探针,28,第一节 核酸探针四、探针的检测-放射性同位素探针的检测,1.放射自显影将杂交膜与X胶片在暗盒中曝光一定时间2.液体闪烁计数法-计数器 杂交
12、膜剪成小块，真空干燥后转入闪烁瓶，加入闪烁液，在液闪仪上自动计数,28第一节 核酸探针四、探针的检测-放射性同位素探针,29,1酶促显色法 2荧光法 3化学发光法 4多探针检测法,非放射性探针检测示意图,第一节 核酸探针四、探针的检测-非放射性的探针的检测,29 1酶促显色法 2荧光法,30,常用核酸探针的标记和检测,第一节 核酸探针,30常用核酸探针的标记和检测第一节 核酸探针,31,第二节 核酸分子杂交的类型,一、反向点杂交二、Southern印迹杂交三、Northern印迹杂交 四、原位杂交 其它命名如：斑点杂交 菌落杂交 微板酶联杂交,31第二节 核酸分子杂交的类型一、反向点杂交,32
13、,固相杂交 探针 被测DNA（RNA） 在固体支持物上杂交 容易洗膜,液相杂交 探针 被测DNA（RNA） 在液体中杂交 灵敏度高,按照杂交的反应条件分为固相和液相杂交两类：,第二节 核酸分子杂交的类型杂交分类,正向杂交（靶序列固定）反向杂交（探针固定）,32固相杂交液相杂交按照杂交的反应条件分为固相和液相杂,33,分子杂交技术一般过程, 探针制备及标记（同位素或非同位素） 待测核酸样品制备（分离，纯化） 杂交（液相，固相，原位杂交） 杂交后处理（去掉非特异杂交分子） 显示结果（显色，发光，放射自显影） 结果分析,第二节 核酸分子杂交的类型,33分子杂交技术一般过程 探针制备及标记（同位素或非
14、同位素,34,核酸分子杂交技术类型,第二节 核酸分子杂交的类型,34核酸分子杂交技术类型 第二节 核酸分子杂交的类型,35,点杂交正向：是将待检样（DNA、 RNA 或细胞）直接点到膜上，烘烤固定反向：是将探针固定在膜上,第二节 核酸分子杂交的类型一、反向点杂交（reverse dot blot，RDB）,35点杂交第二节 核酸分子杂交的类型一、反向点杂交（,36,反向点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程简便、快速一张膜上可以同时固定多个探针，进行多个位点检测特别适合做点突变,第二节 核酸分子杂交的类型一、反向点杂交,36反向点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程简便、快速第二,37,线粒体
15、DNA的8个突变位点膜杂交结果,3256,3290,3316,3394,3593,3606,3618,3688,野生型,突变型,第三节 核酸分子杂交技术一、反向点杂交,37线粒体DNA的8个突变位点膜杂交结果3256329033,38,Southern印迹杂交是应用DNA探针检测特异DNA的一种膜上印迹技术是由英国爱丁堡大学的E.M.Southern于1975年建立的。主要用于分析基因是否发生突变,第二节 核酸分子杂交的类型二、Southern印迹杂交,38Southern印迹杂交是应用DNA探针检测特异DNA的,39,DNA变性 中和 Southern印迹 预杂交 杂交 洗膜 检测,第二节
16、核酸分子杂交的类型二、Southern印迹杂交,39DNA变性 中和 Southern,40,毛细管转移示意图,第二节 核酸分子杂交的类型二、Southern印迹杂交,40 毛细管转移示意图第二节 核酸分子杂交的类型二、,41,电转移示意图,第二节 核酸分子杂交的类型二、Southern印迹杂交,41电转移示意图第二节 核酸分子杂交的类型二、Sou,42,Northern印迹(Northern blot)杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术是由Alwine于1977年建立的。后经Thomas等人改进主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的转录情况,第二节 核酸分子杂交的类型
17、三、Northern印迹杂交,42Northern印迹(Northern blot)杂交是,43,Northern印迹杂交流程图,第二节 核酸分子杂交的类型三、Northern印迹杂交,43Northern印迹杂交流程图 第二节 核酸分子杂交,44,与Southern印迹杂交比较：,RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染所用的器材最好与Southern印迹实验的分开使用RNA变性的方法：不能用碱变性，因为碱会水解RNA 2-OH变性剂的作用：防止RNA分子形成发夹式的二级结构，以保持其单链线形状态,第二节 核酸分子杂交的类型三、Northern印迹杂交,44与Southern印迹杂交比较：R
18、NA提取过程中需特别注,45,原位杂交（In situ hybridization ）是以特定标记的核酸探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并用组化或免疫组化等方法对其检测的技术。,第二节 核酸分子杂交的类型四、原位杂交,它属于固相分子杂交的范畴，但有别于其它任何固相核酸分子杂交技术,45原位杂交（In situ hybridization ）,46,原位杂交技术除了具有核酸分子杂交的特异性高的特点之外，并可精确定位，因此该技术已广泛地应用于医学分子生物学的研究之中其应用有以下几方面：正常或异常染色体的基因定位应用核酸探针与细胞内RNA进行杂交，检测基因表达水平应用特异的病原体核酸作为探针对组织
19、、细胞进行杂交，以检测有无该病原体的感染等,第二节 核酸分子杂交的类型四、原位杂交,46原位杂交技术除了具有核酸分子杂交的特异性高的特点之外，并,47,石蜡包埋组织切片冰冻切片细胞涂片培养细胞爬片,第二节 核酸分子杂交的类型四、原位杂交-原位杂交材料,47石蜡包埋组织切片第二节 核酸分子杂交的类型四、原,48,细胞或组织切片的处理玻片清洗组织和细胞的固定增强组织的通透性和核酸探针的穿透性预杂交杂交杂交后漂洗结果检测,第二节 核酸分子杂交的类型四、原位杂交-基本方法,48细胞或组织切片的处理第二节 核酸分子杂交的类型四,49,荧光原位杂交（fluorescence in-situ hybridi
20、zation, FISH）是一种利用非放射性的荧光素标记，对原位杂交样本进行检测的技术,第二节 核酸分子杂交的类型荧光原位杂交,49荧光原位杂交（fluorescence in-situ,50,生物素标记探针与荧光素标记的抗生物素抗体 地高辛标记的抗体与荧光素标记的抗地高辛抗体氨乙酰基荧光（aminoacetylfluroence,AAF）-改良探针与抗AAF抗血清等 上述的检测系统有直接法和间接法两种，后者灵敏度更高,第二节 核酸分子杂交的类型荧光原位杂交-荧光素标记检测系统,50生物素标记探针与荧光素标记的抗生物素抗体 第二节 核,51,FISH技术在染色体分析中的应用,第二节 核酸分子杂
21、交的类型荧光原位杂交,51FISH技术在染色体分析中的应用第二节 核酸分子杂交,52,菌落杂交示意图,第二节 核酸分子杂交的类型菌落杂交,52菌落杂交示意图第二节 核酸分子杂交的类型菌落杂交,53,核酸分子浓度（靶核酸、单链探针）高浓度双链探针：自身复性碱基组成：G+C的含量（含量越高，杂交速度越快，稳定性越好）；Tm值 盐浓度：与速度成正比，但1mol/L的NaCl达到平台期（经验）稳定性：高离子促进杂交分子的稳定，低盐高温有利于非特异性杂交的探针的洗脱。温度：越高杂交速度越快；注意Tm值 RNA：DNA杂化：低于Tm值1015，DNA：DNA杂化：低于Tm值2025，达到最大速率甲醛：降低
22、Tm值，低温易于固定，提高稳定性错配加速剂：很少使用,第三节 杂交的影响因素一、长探针杂交的影响因素-杂交速率与杂化分子的稳定性,53核酸分子浓度（靶核酸、单链探针）第三节 杂交的影响因,54,酶联探针：酶对Tm值的影响，酶的稳定性杂交反应体积：越小越好杂交时间：RNA：DNA;DNA：DNA杂交：6-18小时；RNA：RNA杂交：10-12小时特异性与灵敏度的矛盾,第三节 杂交的影响因素一、长探针杂交的影响因素,54酶联探针：第三节 杂交的影响因素一、长探针杂交的,55,Tm值比较低，稳定性较差。影响杂交稳定的因素：Tm值的影响（四胺盐消除碱基序列对Tm值的影响，只考虑碱探针的长度；碱基的错配减低稳定性），盐溶液（一般不调整）杂交时间：寡核苷酸杂化双链不稳定，杂交时间短，一般23小时，加速剂：很少用，本身杂交速度比较快，不会自身复性洗脱条件：时间短杂交条件优化：杂交的温度、盐浓度、洗脱时间等,第三节 杂交的影响因素二、短小寡核苷酸探针杂交的影响因素,55Tm值比较低，稳定性较差。第三节 杂交的影响因素,56,基因突变的分析基因表达的研究基因定位的研究基因克隆的筛选,核酸杂交的主要应用,56核酸杂交的主要应用,
