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1、第三章 病毒感染力的滴定,病毒感染力的滴定,1,第三章 病毒感染力的滴定病毒感染力的滴定1,半数致死量LD50（50% lethal dose）半数鸡胚感染量EID50 (egg 50% infective dose)半数细胞培养物感染量TCID50（tissue culture 50% infective dose)蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）,测定病毒感染力的方法:,病毒感染力的滴定,2,半数致死量LD50（50% lethal dose）测定病毒,一、病毒TCID50的测定操作步骤,在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。 将稀释好
2、的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种100l。在每孔加入细胞悬液100l，使细胞量达到3105个/ml。,病毒感染力的滴定,3,一、病毒TCID50的测定在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀,设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法,病毒感染力的滴定,4,设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。病毒感染力的滴定4,TCID50的计算方法,病毒感染力的滴定,5,TCID50的计算方法病毒感染力的滴定5,Calculation of TCID50,Use of Reed & Muen
3、ch method (if 50 ul of virus dilution is added to each well),病毒感染力的滴定,6,Calculation of TCID50 Use of R,病毒液 CPE孔数 无CPE 累 计 出现CPE孔稀释度 孔数 CPE孔数 无CPE孔数 所占的% 10-1 8 0 27 0 100（27/27） 10 -2 8 0 19 0 100（19/19） 10 -3 7 1 11 1 91.6 （11/12） 10 -4 3 5 4 6 40（4/10） 10 -5 1 7 1 13 0.7（1/14） 10 -6 0 8 0 21 0（0/2
4、1）,Reed-Muench两氏法,病毒感染力的滴定,7,病毒液 CPE孔数 无CPE,距离比例（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数） （91.6-50）/（91.6-40） 0.8,病毒感染力的滴定,8,距离比例（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%,lgTCID50=距离此例稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数 =0.8(-1)+(-3) =-3.8 TCID50=10-3.80.1ml,病毒感染力的滴定,9,lgTCID50=距离此例稀释度对数之间的差+高于50%病,Karber法,病毒感染力的滴定,10,K
5、arber法 病毒液稀释度,lgTCID50=L-d(s-0.5)L: 最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID50=-1-1(3.375-0.5) =-3.875 TCID50=10-3.875/0.1ml,病毒感染力的滴定,11,lgTCID50=L-d(s-0.5)病毒感染力的滴定11,二、病毒蚀斑技术病毒蚀斑（plaque) 又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。,病毒感染力的滴定,12,二、病毒蚀斑技术病毒感染力的滴定12,原理：适当稀释的病毒悬液接种经长成单层的敏感细胞后，在覆盖的固体或半固体介质（琼脂糖、甲基纤维素）的作用下，病毒在最初
6、感染的细胞内增殖后，只能进而感染并破坏临近的细胞，经过几个增殖周期后，形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区，即局限性的病灶。,病毒感染力的滴定,13,原理：适当稀释的病毒悬液接种经长成单层的敏感细胞后，在覆盖的,Procedures,病毒感染力的滴定,14,Procedures病毒感染力的滴定14,操作步骤,将敏感细胞在平皿或6孔板内培养成单层吸弃培养液，加入含钙、镁的PBS（pH7.4）洗1-2次。用维持液将病毒液作连续10倍的稀释，选择适当稀释度的病毒悬液接种培养孔内的单层细胞，接种量约为原培养液的1/10-1/5，以覆盖住细胞单层为宜，每个稀释度接种2-3孔。,病毒感染力的滴定,15,操
7、作步骤将敏感细胞在平皿或6孔板内培养成单层病毒感染力的滴定,将培养板置37 5% CO2培养箱吸附1h，吸弃病毒液，用含钙、镁的PBS（pH7.4）洗3次。取1.6%-2%的低熔点琼脂糖，融化后降温至38-42，与等量预热至38-42含6%-10%犊牛血清的无酚红DMEM混合，注入细胞培养板中。,病毒感染力的滴定,16,将培养板置37 5% CO2培养箱吸附1h，吸弃病毒液，用,室温放置直至琼脂糖凝固，或于4冰箱放置几分钟至琼脂糖凝固，然后于37 5% CO2培养箱继续培养。 每天于显微镜下观察细胞病变情况。出现空斑后（2-3天），用含钙、镁的PBS将0.1%的中性红贮存液10倍稀释后滴加到细
8、胞培养板上。于37 5% CO2培养箱中作用1h，吸弃染液，继续于温箱中培养2-3h。,病毒感染力的滴定,17,室温放置直至琼脂糖凝固，或于4冰箱放置几分钟至琼脂糖凝固，,TK-突变株与野毒形成的空斑的比较,病毒感染力的滴定,18,TK-突变株与野毒形成的空斑的比较病毒感染力的滴定18,如果是测定PFU，则直接记取一定稀释度的病毒所形成的空斑数，然后根据公式计算PFU。如果是作病毒纯化,挑取空斑于200L维持液中，反复冻融3次，接种于PK-15细胞已长成单层的24孔细胞培养板，再于37 5% CO2培养箱培养至完全发生病变。,病毒感染力的滴定,19,如果是测定PFU，则直接记取一定稀释度的病毒
9、所形成的空斑数，,一般的毒种纯化：收集病变的细胞悬液，测定TCID50，然后选TCID50较高者再作几轮空斑纯化，获得高滴度的病毒，扩大培养后作种用。筛选重组病毒：收集病变的细胞或病毒悬液，通过PCR或其它方法进行鉴定，取阳性者再作下一轮空斑纯化。如此3-5轮空斑纯化后即可得到纯化的病毒粒子。,病毒感染力的滴定,20,一般的毒种纯化：收集病变的细胞悬液，测定TCID50，然后选,噬斑技术的应用：,用于病毒纯化：挑选病毒的克隆株测定病毒悬液中感染病毒的含量,病毒感染力的滴定,21,噬斑技术的应用：用于病毒纯化：挑选病毒的克隆株病毒感染力的滴,噬斑形成单位（plaque forming unit, PFU）,概念： 每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即病毒悬液中的感染性病毒浓度。计算方法： 如用PRV接种PK-15细胞，每孔接种了0.4ml，结果10-5孔形成了208个空斑，而10-6孔形成了22个空斑，则该病毒在PK-15细胞上的空斑形成单位（PFU）为：22106/0.4ml=5.5107个/ml。,病毒感染力的滴定,22,噬斑形成单位（plaque forming unit, PF,
